摘要：自然環(huán)境中的微/納米塑料污染日趨嚴(yán)重，但納米塑料對(duì)農(nóng)作物生長(zhǎng)的潛在影響尚不清楚。通過(guò)營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)方式，探討了粒徑為80nm的聚苯乙烯納米塑料(polystyrenenanoplastics,PS-NPs)對(duì)金鄉(xiāng)大蒜(AlliumsativumL.)葉綠素含量、抗氧化性能和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響。結(jié)果顯示，添加PS-NPs處理的大蒜，其葉片葉綠素含量均顯著低于對(duì)照組，葉綠素的合成受到抑制。大蒜葉片SOD、APX活性和脯氨酸含量隨著PS-NPs質(zhì)量濃度的增加呈先升高后降低的趨勢(shì)。10d處理時(shí)大蒜葉片POD活性隨PS-NPs質(zhì)量濃度的增加而上升，但在20d處理時(shí)，各處理組POD活性均受到抑制。大蒜葉片MDA含量隨PS-NPs質(zhì)量濃度的增加而增加，在ρ(PS-NPs)為100mg·L-1處理下，10d和20d處理時(shí)其含量相比對(duì)照分別增加43.24%和89.70%。同時(shí)，經(jīng)ρ(PS-NPs)為100mg·L-1脅迫處理10d后，大蒜葉片可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖和維生素C含量均高于對(duì)照組，但20d后，維生素C含量較對(duì)照則降低了26.53%。以上結(jié)果表明PS-NPs能對(duì)大蒜產(chǎn)生較為顯著的氧化脅迫效應(yīng)，且較高質(zhì)量濃度的PS-NPs脅迫會(huì)對(duì)大蒜葉片的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)產(chǎn)生一定的影響。

　　關(guān)鍵詞：金鄉(xiāng)大蒜;納米塑料;生長(zhǎng)生理;抗氧化酶;營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)

　　據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年塑料生產(chǎn)量已超過(guò)3.2億t，多達(dá)74%的塑料垃圾最終被排放到環(huán)境中[1]。在物理、化學(xué)和微生物等作用下，塑料垃圾會(huì)被分解成無(wú)數(shù)微小的塑料碎片或顆粒[2]。同時(shí)，個(gè)人護(hù)理品中的塑料微珠以及人造紡織品聚合纖維等微塑料，也會(huì)直接進(jìn)入環(huán)境。早在2004年，英國(guó)學(xué)者Thompson等[3]在研究海洋塑料垃圾污染時(shí)提出“微塑料”這一概念。

　　一般認(rèn)為，當(dāng)塑料碎片或顆粒的尺寸小于5mm時(shí)，即被定義為微塑料[4]。理論上，環(huán)境中的微塑料仍然會(huì)進(jìn)一步分解，最終可形成尺寸小于100nm的納米塑料[5]。Besseling等[6]通過(guò)研究證實(shí)，在條件充分時(shí)，一個(gè)微塑料顆粒可以破碎成1014個(gè)以上的納米塑料。納米塑料體積小，比表面積大，使其很容易吸附攜帶其它污染物[7]。相較于微塑料，納米塑料也更容易被生物體吞食或被動(dòng)攝入[8]，然后通過(guò)食物鏈在高營(yíng)養(yǎng)層生物體內(nèi)富集[9,10]，其毒性實(shí)驗(yàn)也表明納米塑料對(duì)生物體和人類健康存在潛在危害[11]。

　　近年來(lái)，陸地生態(tài)系統(tǒng)中納米塑料污染受到廣泛重視，尤其是農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中的納米塑料對(duì)農(nóng)作物生長(zhǎng)的潛在危害[12-16]。連加攀等[17]的研究指出，粒徑為50nm的乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、線性低密度聚乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯納米塑料能夠?qū)π←?TriticumaestivumL.)種子的發(fā)芽和生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用。Jiang等[18]的研究發(fā)現(xiàn)100nm的聚苯乙烯微球能夠干擾蠶豆(ViciafabaL.)生長(zhǎng)過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸，并對(duì)作物產(chǎn)生遺傳毒性。

　　Giorgetti等[19]的研究結(jié)果也表明：50nm的聚苯乙烯微球能誘導(dǎo)洋蔥(AlliumcepaL.)細(xì)胞毒性(降低有絲分裂指數(shù))、基因毒性(細(xì)胞遺傳異常和微核的誘導(dǎo))和氧化損傷。整體而言，關(guān)于納米塑料對(duì)高等植物的影響研究仍然偏少，納米塑料對(duì)作物生長(zhǎng)和品質(zhì)的影響尚不清晰。大蒜是著名的食藥兩用植物，其蒜頭和蒜葉均可作蔬菜食用。聚苯乙烯是使用最為廣泛的塑料材料，常用于塑料杯、塑料薄膜等包裝盒和建筑保溫等產(chǎn)業(yè)，已成為土壤、湖泊和海洋的主要污染物[20]。因此，本研究選用廣泛種植的金鄉(xiāng)大蒜(AlliumsativumL.)作為供試材料，以粒徑為80nm的聚苯乙烯納米顆粒(polystyrenenanoplastics,PS-NPs)作為脅迫物質(zhì)，探討不同質(zhì)量濃度的PS-NPs對(duì)大蒜葉片葉綠素含量、抗氧化性能和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響，以期為后續(xù)評(píng)估納米塑料對(duì)農(nóng)作物的影響提供參考依據(jù)。

　　1材料與方法

　　1.1塑料微球

　　本研究采用由Nileblue熒光染料標(biāo)記的紅色熒光PS-NPs，購(gòu)自大鵝(天津)科技有限公司。PS-NPs呈球形，平均粒徑為80nm，變異系數(shù)<5%，在水相中分散和保存，原液中ρ(PS-NPs)為10000mg·L-1。

　　1.2供試大蒜和培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

　　挑選飽滿且大小一致的金鄉(xiāng)大蒜蒜瓣，先用2%H2O2溶液浸泡約30min，進(jìn)行表面滅菌，隨后用超純水多次漂洗去除殘留H2O2。用吸水紙擦拭干凈后，放置于直徑12cm的玻璃培養(yǎng)皿中。每盤(pán)處理放置12粒蒜瓣，加入20%Hoagland營(yíng)養(yǎng)液160mL，隨后整盤(pán)置于光照培養(yǎng)箱(SPX-250B-G，上海博迅)中培養(yǎng)6d，待其莖盤(pán)長(zhǎng)出短根及頂部冒出細(xì)牙后進(jìn)行脅迫實(shí)驗(yàn)。在脅迫實(shí)驗(yàn)中，取適量PS-NPs原液，用20%Hoagland營(yíng)養(yǎng)液稀釋，使培養(yǎng)液中ρ(PS-NPs)分別為1、10、50和100mg·L-1，取160mL培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。設(shè)置培養(yǎng)箱溫度為22℃±1℃，光照時(shí)間為13h，光照強(qiáng)度約9900lx。培養(yǎng)過(guò)程中每日早晚各添加適量純水補(bǔ)充蒸發(fā)量，每3d更換一次培養(yǎng)液。

　　在PS-NPs處理第10d和第20d采集植物葉片后測(cè)定。Hoagland營(yíng)養(yǎng)液[21]成分為5.00mmol·L-1Ca(NO3)2·4H2O、5.04mmol·L-1KNO3、1.99mmol·L-1MgSO4·7H2O、1.03mmol·L-1KH2PO4、8.99μmol·L-1Fe2(C4H4O6)3、9.70μmol·L-1H3BO3、2.02μmol·L-1MnCl2·4H2O、0.31μmol·L-1ZnSO4、0.20μmol·L-1CuSO4·5H2O和0.09μmol·L-1H2MoO4·4H2O。取PS-NPs原液時(shí)，先超聲(120W)振動(dòng)5min以保證取樣均勻。

　　同時(shí)培養(yǎng)液中每天早晚補(bǔ)水后適當(dāng)攪拌，以保證培養(yǎng)液中納米塑料質(zhì)量濃度均勻。葉片采集和后處理：先使用去離子水清洗大蒜葉片表面，用吸水紙擦拭干凈，然后使用手術(shù)剪刀分別剪取大蒜葉片中段。取樣完成后迅速完成部分指標(biāo)測(cè)定，其余樣本先液氮速凍，然后迅速置于超低溫冷凍儲(chǔ)存箱(DW-HL100，中科美菱)中保存待測(cè)。

　　1.3指標(biāo)測(cè)定方法葉綠素采用丙酮乙醇浸提法測(cè)定[22]，超氧化物歧化酶(SOD)采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定[23]，過(guò)氧化物酶(POD)采用愈創(chuàng)木酚顯色法測(cè)定[24]，抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)采用紫外分光光度法測(cè)定[25]，脯氨酸采用酸性茚三酮顯色法測(cè)定[26]，丙二醛(MDA)采用硫代巴比妥酸顯色法測(cè)定[26]，可溶性蛋白質(zhì)采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定[25]，可溶性糖采用蒽酮比色法測(cè)定[25]，維生素C采用比色法測(cè)定[25]。以上所有指標(biāo)均采用試劑盒檢測(cè)。所有試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

　　1.4數(shù)據(jù)處理本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用SPSS26.0進(jìn)行單因素ANOVA檢驗(yàn)分析，以Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行事后多重比較(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(Mean±SD)表示，圖形均采用Origin2018軟件繪制。

　　2結(jié)果與討論

　　2.1PS-NPs對(duì)葉綠素含量的影響

　　光合作用是植物必需的重要生理過(guò)程，能為植物生長(zhǎng)和生物量的增加提供重要幫助，葉綠素含量的多少又能直接影響光合作用的強(qiáng)弱[27]。可見(jiàn)，添加PS-NPs處理后，葉片葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量都顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，且都在ρ(PS-NPs)為1mg·L-1處理時(shí)出現(xiàn)最低值。Lian等[28]的研究結(jié)果表明，在100nm的PS-NPs脅迫下，生菜(LactucasativaL.)葉片的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量皆低于對(duì)照，與本研究結(jié)果一致。

　　葉綠素的合成是一個(gè)由多酶參與的復(fù)雜過(guò)程[29]，PS-NPs脅迫可能會(huì)降低合成關(guān)鍵酶活性，從而使得葉片葉綠素含量下降。本實(shí)驗(yàn)中添加PS-NPs處理后，葉綠素含量均隨PS-NPs質(zhì)量濃度的增加而上升，這可能是因?yàn)榉巧�物逆境脅迫促使葉片濃縮，從而導(dǎo)致單位面積的葉綠素含量增加[30]，還有可能是在逆境脅迫下，葉綠素與葉綠體蛋白間的結(jié)合逐漸松弛，葉綠素更容易被提取，最終導(dǎo)致葉綠素含量增加[31]。

　　2.2PS-NPs對(duì)大蒜葉片的氧化損傷

　　SOD作為抗氧化防御的第一道防線，對(duì)機(jī)體氧化和抗氧化的平衡至關(guān)重要[32]。經(jīng)PS-NPs脅迫處理10d和20d后，SOD活性隨PS-NPs質(zhì)量濃度的增加均呈先升高后降低的趨勢(shì)，在ρ(PS-NPs)為10mg·L-1時(shí)，SOD活性相比對(duì)照分別上升了17.98%和7.33%，且差異顯著(P<0.05)。當(dāng)ρ(PS-NPs)增大至100mg·L-1時(shí)，第10d和20d處理下，SOD活性相比對(duì)照分別降低了13.42%和20.87%，這表明高質(zhì)量濃度的PS-NPs處理會(huì)顯著抑制大蒜葉片的SOD活性。

　　PS-NPs對(duì)大蒜葉片POD活性的影響。10d處理時(shí)，POD活性隨PS-NPs質(zhì)量濃度的增加而上升，在ρ(PS-NPs)為100mg·L-1時(shí)，POD活性相比對(duì)照上升了138.55%，差異顯著(P<0.0520dpodps-npsps-nps50mgl-1100mgl-1pod46.2251.6910dps-npspodpodapxh2o233ps-npsapx2cps-nps10dapx74.33897.17179.937.57ps-nps10dapx20dapxps-nps1mgl-1100mgl-129.1158.44p>0.05)。這表明在本實(shí)驗(yàn)PS-NPs質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，PS-NPs脅迫處理20d內(nèi)不會(huì)顯著抑制APX活性。

　　脯氨酸是一種可溶性滲透劑，能作為滲透調(diào)節(jié)介質(zhì)、自由基清除劑和高分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定劑來(lái)幫助植物抵御外界環(huán)境脅迫[34]。PS-NPs對(duì)大蒜葉片脯氨酸含量的影響。可見(jiàn)，脯氨酸含量隨PS-NPs質(zhì)量濃度的增加呈先增加后減少的趨勢(shì)。在ρ(PS-NPs)為10mg·L-1時(shí)，10d處理下，葉片脯氨酸含量達(dá)到峰值，最高脯氨酸含量相比對(duì)照增加了308.27%。而當(dāng)ρ(PS-NPs)增加至100mg·L-1時(shí)，在20d處理下，葉片脯氨酸含量相比對(duì)照則減少12.77%。

　　MDA常常反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化程度，也可間接地反映出細(xì)胞的氧化損傷程度[26]。經(jīng)PS-NPs脅迫處理后，大蒜葉片MDA含量隨著PS-NPs質(zhì)量濃度的增加而增加，在ρ(PS-NPs)為100mg·L-1、脅迫處理20d時(shí)，MDA含量達(dá)到最高，相比對(duì)照增加了89.70%。且在同一質(zhì)量濃度的PS-NPs處理時(shí)，脅迫時(shí)間越長(zhǎng)，MDA含量也越高。這表明隨著PS-NPs質(zhì)量濃度增大和脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，大蒜葉片的脂質(zhì)過(guò)氧化程度和細(xì)胞損傷程度在逐漸加重。SOD可清除機(jī)體內(nèi)過(guò)量產(chǎn)生的超氧陰離子自由基(O2-·)，使之發(fā)生歧化反應(yīng)，生成H2O2和O2[35]。

　　隨后，POD和APX活性也將被激活，催化分解H2O2生成H2O和O2[36]。Zhou等[37]的研究表明，在粒徑20nm的PS-NPs作用下，水稻根系SOD活性隨著PS-NPs質(zhì)量濃度的增加而上升，與本實(shí)驗(yàn)中ρ(PS-NPs)≤10mg·L-1處理10d時(shí)的結(jié)果較一致。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)ρ(PS-NPs)為100mg·L-1脅迫處理后，大蒜葉片的SOD活性被顯著抑制，這可能是由于產(chǎn)生的過(guò)量自由基已超過(guò)酶作用閾值[37]，且生成的過(guò)量H2O2也會(huì)抑制SOD活性[38]。

　　此外，在ρ(PS-NPs)為100mg·L-1時(shí)，10d后大蒜葉片的POD和APX活性均高于對(duì)照，這可能是因?yàn)檠趸�脅迫增強(qiáng)，植物體通過(guò)提高這兩種酶活性使自身免受傷害[25];但20d后兩者活性都受到抑制，這可能是由于H2O2的積累速度大于植物保護(hù)系統(tǒng)清除的速度，造成H2O2過(guò)度積累，從而導(dǎo)致酶活性出現(xiàn)抑制現(xiàn)象[39]。NPs具有顯著誘導(dǎo)APX酶基因表達(dá)的能力[40]，如在粒徑為100nm的PS-NPs脅迫下，黃瓜(CucumissativusL.)葉片APX酶基因相對(duì)表達(dá)水平提高了600%以上[25]。

　　本實(shí)驗(yàn)中，在ρ(PS-NPs)為10mg·L-1時(shí)，10d脅迫下APX活性達(dá)到最大，推測(cè)可能是此時(shí)PS-NPs誘導(dǎo)的APX酶基因表達(dá)量顯著增加，從而使得APX活性顯著上升。本實(shí)驗(yàn)中脯氨酸含量總體呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，這表明在一定PS-NPs質(zhì)量濃度脅迫時(shí)，大蒜體內(nèi)的脯氨酸能作為有效的抗氧化劑清除自由基，調(diào)節(jié)大蒜體內(nèi)的氧化平衡狀態(tài)。從MDA含量變化來(lái)看，由于抗氧化酶活性在ρ(PS-NPs)為100mg·L-1、脅迫處理20d時(shí)都被抑制，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化程度顯著上升，即MDA含量顯著增加(P<0.05)，這也間接反映出高質(zhì)量濃度PS-NPs的存在可對(duì)大蒜造成氧化損傷[41]。

　　2.3PS-NPs對(duì)大蒜葉片營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響

　　蛋白質(zhì)、糖類和維生素等是植物體內(nèi)重要的營(yíng)養(yǎng)素，其含量的多少也可直接或間接反映出植物營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的高低[42]。PS-NPs脅迫下大蒜葉片可溶性蛋白質(zhì)含量，經(jīng)PS-NPs處理10d后，當(dāng)ρ(PS-NPs)≤50mg·L-1時(shí)大蒜葉片可溶性蛋白質(zhì)含量略低于對(duì)照，但當(dāng)ρ(PS-NPs)增加至100mg·L-1時(shí)，可溶性蛋白質(zhì)含量較對(duì)照增加9.45%。

　　在PS-NPs脅迫處理20d后，大蒜葉片可溶性蛋白質(zhì)含量均高于對(duì)照，但增加均不顯著(>0.05)。可溶性糖含量在ρ(PS-NPs)為10mg·L-1和50mg·L-1時(shí)均顯著低于對(duì)照，PS-NPs的存在降低了大蒜葉片可溶性糖含量，表現(xiàn)出抑制作用;但在ρ(PS-NPs)為100mg·L-1時(shí)，處理10d和20d后，可溶性糖含量相比對(duì)照分別升高了2.50%和44.65%，表現(xiàn)出促進(jìn)作用。

　　10d處理時(shí)，PS-NPs脅迫使得維生素C含量顯著增加。但20d處理時(shí)，維生素C含量呈先上升后下降的趨勢(shì)，并在ρ(PS-NPs)≥10mg·L-1時(shí)開(kāi)始低于對(duì)照。當(dāng)ρ(PS-NPs)增加至100mg·L-1時(shí)，維生素C含量較對(duì)照降低26.53%，達(dá)到差異顯著水平(<0.054344l.sativaps-npslian28ps-nps1mgl-1l.sativaps-nps1mgl-110d>0.05)，而此時(shí)可溶性糖含量要顯著高于對(duì)照，這可能是可溶性糖含量的增加緩解了PS-NPs的脅迫，進(jìn)而可溶性蛋白質(zhì)含量并未發(fā)生顯著變化[45]。

　　維生素C具有清除體內(nèi)自由基、預(yù)防癌癥的作用，還有增強(qiáng)人體免疫功能、預(yù)防和治療缺鐵性貧血等多種功能，同時(shí)，維生素C作為植物抗氧化系統(tǒng)中的非酶性物質(zhì)，對(duì)于抵御外界的非生物脅迫具有重要作用[46]。本研究中，10d處理時(shí)維生素C含量顯著增加，表明此時(shí)維生素C參與了緩解PS-NPs帶來(lái)的脅迫效應(yīng)。在ρ(PS-NPs)為100mg·L-1時(shí)，20d脅迫使得維生素C含量顯著下降，可能是高氧化脅迫環(huán)境造成維生素C合成量下降，也可能是清除體內(nèi)過(guò)量的自由基需要消耗大量的維生素C，消耗量大于合成量所致[47]。

　　3結(jié)論

　　(1)在粒徑為80nm的PS-NPs脅迫下，大蒜葉片的光合色素(葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素)含量均顯著低于對(duì)照，表明80nm的PS-NPs能顯著影響金鄉(xiāng)大蒜葉片葉綠素的合成過(guò)程。(2)80nm的PS-NPs能對(duì)大蒜葉片造成氧化脅迫，植物則可以通過(guò)提高SOD、POD、APX酶活性和脯氨酸含量來(lái)緩解一定程度的氧化脅迫環(huán)境。(3)80nm的PS-NPs對(duì)大蒜葉片可溶性蛋白質(zhì)含量的影響不顯著，對(duì)可溶性糖、維生素C含量的影響和PS-NPs質(zhì)量濃度、脅迫時(shí)間有關(guān)，納米塑料對(duì)大蒜葉片營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響還需進(jìn)一步研究。

　　參考文獻(xiàn)：

　　[1]AlimiOS,FarnerBJ,HernandezLM,etal.Microplasticsandnanoplasticsinaquaticenvironments:Aggregation,deposition,andenhancedcontaminanttransport[J].EnvironmentalScience&Technology,2018,52(4):1704-1724.

　　[2]任欣偉,唐景春,于宸,等.土壤微塑料污染及生態(tài)效應(yīng)研究進(jìn)展[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2018,37(6):1045-1058.RenXW,TangJC,YuC,etal.Advancesinresearchontheecologicaleffectsofmicroplasticpollutiononsoilecosystems[J].JournalofAgro-EnvironmentScience,2018,37(6):1045-1058.

　　[3]ThompsonRC,OlsenY,MitchellRP,etal.Lostatsea:Whereisalltheplastic?[J].Science,2004,304(5672):838-838.

　　[4]LawKL,ThompsonRC.Microplasticsintheseas[J].Science,2014,345(6193):144-145.

　　[5]楊婧婧,徐笠,陸安祥,等.環(huán)境中微(納米)塑料的來(lái)源及毒理學(xué)研究進(jìn)展[J].環(huán)境化學(xué),2018,37(3):383-396.YangJJ,XuL,LuAX,etal.Researchprogressonthesourcesandtoxicologyofmicro(nano)plasticsinenvironment[J].EnvironmentalChemistry,2018,37(3):383-396.

　　[6]BesselingE,RedondoHP,FoekemaEM,etal.Quantifyingecologicalrisksofaquaticmicro-andnanoplastic[J].CriticalReviewsinEnvironmentalScience&Technology,2019,49(1):32-80.

　　[7]ShenMC,ZhangYX,ZhuY,etal.Recentadvancesintoxicologicalresearchofnanoplasticsintheenvironment:Areview[J].EnvironmentalPollution,2019,252,doi:10.1016/j.envpol.2019.05.102.

　　作者：邱陳陳1，李國(guó)新1*，李青松1，顏昌宙2