摘要熒光/光聲成像和光療技術的生物醫學應用引起了人們越來越多的關注，然而很多熒光/光聲造影劑存在生物相容性較差，缺乏腫瘤靶向性，信噪比較低，功能單一等共性問題，嚴重限制其診療應用。透明質酸具有優異的生物相容性和主動腫瘤靶向性，可被透明質酸酶降解，并且易于化學修飾和實現多種超分子弱相互作用力協同工作。因此，人們將透明質酸與熒光/光聲造影劑結合制備納米材料，使其在細胞乃至活體的標記性能和治療效果獲得了很大的改善。本文綜述了將兩類物質結合制備納米材料的方法，著重闡述了納米材料的結構與性能關系，為其未來設計和開發提供了指導，最后對存在的主要問題以及未來的重要研究方向進行了分析和展望。

　　關鍵詞透明質酸;熒光成像;光聲成像;光熱治療;光動力治療

　　1引言

　　對惡性腫瘤的早期診斷和有效治療是提高治愈率和存活率的一個重要手段[1-2]。作為用于惡性腫瘤臨床早期診斷和定位的非侵入式新興影像技術，熒光(FL)成像和光聲(PA)成像在生物醫學領域的研究和應用引起了人們的高度重視[3-7]。它們不需使用放射性物質，具有實時動態監測、靈敏度高和費用較低等優點，而且有可能在成像的同時進行治療。

　　其中，雙光子、近紅外(NIR)一區(750-1000nm)和NIR二區(1000-1700nm)熒光成像的激發波長在生物光學窗口范圍內，與可見光區成像相比，生物組織對光的吸收和散射比較少，光致損傷小，自發熒光更弱，信噪比高，穿透能力更強，分辨率和靈敏度大幅度提高，近年來被廣泛應用于各種疾病的實驗研究，主要集中在腫瘤、炎癥和心血管疾病的早期診斷和治療效果的動態監測[8-13]。

　　光聲成像則結合了光學成像的高對比度、高分辨率和超聲成像的高穿透性優勢，其原理是生物組織在脈沖近紅外激光照射下吸收光能將之轉為熱能，導致體積周期性膨脹，從而通過收集產生的超聲信號重構生物組織影像，已經在淋巴結、毛細血管、腦部腫瘤等的成像研究中取得了較好的結果[14-17]。而且，有的熒光造影劑被光激發后能同時產生具有強氧化能力的活性氧(ROS)，可以作為光敏劑(PS)，有的光聲造影劑能把吸收的近紅外光能轉化為局部高熱，活性氧和局部高熱在病灶部位能夠有效殺傷疾病細胞。這兩種光療方法分別被稱為光動力治療(PDT)和光熱治療(PTT)，不僅能進行無創疾病治療，還可以通過對外加光源進行控制，很好的區分病灶部位和正常組織，有效提高治療選擇性，減少副作用[17-21]。

　　目前，人們已研究開發出多種熒光/光聲造影劑，可分為無機材料(例如半導體納米晶、貴金屬Au和Ag納米粒子、上轉換納米粒子、碳基納米材料等)和有機材料(例如共軛材料、各種染料小分子等)。將這些造影劑直接進行生物應用時，其性能常存在如下共性問題：①水溶性較差，導致生物相容性低;②缺乏腫瘤靶向性和智能化響應，信噪比較低，對正常組織的毒副作用較大，③功能比較單一，在多模態成像及多種治療方式相結合提高診療效果方面尚需進一步探索。

　　為此，人們將熒光/光聲造影劑與透明質酸(Hyaluronicacid,HA)結合，使其性能獲得了很大的改善。HA是生物體內的天然成分，由葡糖醛酸(GlcUA)和N-乙酰氨基葡糖(GlcNAc)的雙糖單位重復連接形成的鏈狀聚合物，分子中含有的大量羧基、羥基、酰胺基，使其在水溶液中可形成分子內和分子間氫鍵，并產生多級結構。

　　因此，HA具有優異的水溶性和生物相容性，可實現多種超分子弱相互作用力(靜電作用、氫鍵作用、疏水作用和空間匹配等)協同工作，其分子中的四個部位——羥基、N-乙酰氨基、羧基以及還原末端，均可被化學修飾[9]。尤為重要的是，在多種腫瘤病變局部(如乳腺癌、肝癌、腦癌、胰腺癌和膀胱癌等)，若干HA特異性受體的表達會明顯升高(其中最重要是CD44受體)，因而HA衍生物具有主動腫瘤靶向性，并且能被腫瘤細胞中高濃度的透明質酸酶降解[27]。

　　因此，人們將HA和抗癌藥物結合起來，研究開發了大量的靶向給藥體系，很好的改善了藥物輸送和治療的效果[28]。近年來，人們又將熒光/光聲造影劑與HA的優勢特性相結合，獲得了具有較好生物相容性和腫瘤靶向性的納米材料，可同時實現熒光、光聲成像等多模態成像，以及光熱治療、光動力治療或化療的協同治療功能。本文將主要就HA與熒光/光聲造影劑如何結合制備納米材料，及其在熒光、光聲成像和協同治療等方面的應用做一簡要綜述。

　　2透明質酸與熒光/光聲造影劑結合制備納米材料的方法

　　2.1化學修飾方法HA的化學修飾主要在以下三個位點進行：

　　①GlcUA上的羧基，通常在水性條件下先用碳二亞胺和N-琥珀酰亞胺(NHS)或1-羥基苯并三唑(HOBt)使其活化得到活性酯，再與伯胺反應成酰胺或與醇反應成酯;②GlcNAc中C-6位上的羥基，用酸酐、酰氯或環氧化物等使其酯化或成醚;③二糖重復單元的還原端，可以對其進行還原胺化來改性[29]。

　　目前，大部分熒光/光聲造影劑與HA的化學結合位點在羧基，但由于羧基在與HA受體的特異性相互作用中起重要作用，需要注意控制修飾的程度，研究表明對羧基的少量修飾(小于25%)不影響HA有效識別受體[30]。Luo等[31-32]在HA上通過酰胺鍵接枝氟化硼二吡咯甲川染料(BODIPY)，Shi等[33]合成了二碘苯乙烯基BODIPY(DBHA)，使其吸收和發射光譜紅移，并在HA上通過酯鍵進行接枝。

　　3基于透明質酸的納米材料應用于熒光/光聲成像及光療

　　3.1HA與無機造影劑結合

　　無機熒光/光聲造影劑通常存在水溶性和生物相容性差的問題，無法直接用于生物體進行成像或治療;或者粒徑過小，如果小于10nm，在體內循環時容易被腎臟快速清除。

　　3.1.1半導體納米晶體量子點(QD)QD具有寬的激發光譜、窄的發射光譜、可精確調諧的發射波長以及良好的抗光漂白性能等優越特性。Bhang等[34]將用靜電吸附法制備的HA-QD納米粒子對過量表達HA受體的HeLa(宮頸癌)細胞進行熒光成像，證明其具有較好的靶向性和較小的細胞毒性。對裸鼠的耳朵皮下注射HA-QD進行淋巴管系統成像，發現沿著血管內壁具有明亮熒光的淋巴管清晰可見，證明其可與淋巴管內皮受體1(LYVE-1)等作用進入淋巴管內細胞，具有數天的長時間成像能力，有希望用于實時顯示淋巴管生成，而未連接HA的QD成像結果則很模糊。

　　3.1.2Au、Ag納米粒子(NP)Au、AgNP具有獨特的光學性質，包括表面增強，距離/折射率依賴的光譜性質和抗光漂白性能，在近紅外區域有強烈的吸收和有效的光熱轉換。Wu等[41]開發了一類具有核殼結構的Ag-Au@PEG-HA雜化多功能納米凝膠。它以Ag-Au雙金屬NP為核，以熱響應非線性PEG基凝膠為殼，能響應溫度變化產生可逆膨脹和收縮，從而影響Ag-AuNP核的物理化學環境實現熒光傳感，同時控制抗癌藥物替莫唑胺的釋放;凝膠表面通過氫鍵再覆上HA，用于靶向小鼠黑色素瘤B16F10細胞過量表達的CD44受體，提高成像效果。

　　這樣，Ag-Au@PEG-HA將環境響應的熒光傳感、靶向癌細胞的熒光成像、光熱治療、可控藥物釋放等功能結合到一個體系中。Lee等設計了一系列納米Au與HA復合的熒光探針[42-44]。例如，將熒光素標記的HA在還原末端修飾上多巴胺后，通過多巴胺與Au形成比Au-S鍵更加穩定的Au-兒茶酚鍵，并且由于納米粒子HFAuNPs表面能量轉移使熒光素猝滅;而活性氧(ROS)，如超氧陰離子()和羥基自由基()，能降解HA，使熒光素的綠色熒光恢復，從而能實時定量檢測ROS。與常用市售2’,7’-二氯二氫熒光素(DCFH)等ROS探針相比，該探針監測細胞內ROS的性能更優異[42]，可以作為ROS的細胞成像探針。

　　3.2HA與有機造影劑結合

　　與無機材料相比，有機熒光/光聲造影劑易于通過結構設計調控光譜范圍，進行功能化修飾，生物毒性較低;但是水溶性仍需要改善，小分子在體內循環時間短，易被化學分解。

　　3.2.1共軛材料

　　共軛材料包括共軛小分子和聚合物，具有摩爾吸收系數大、熒光量子產率高、光穩定性好和生物毒性較低的優點[24,56]。人們將HA與共軛小分子[57-59]、共軛聚合物[39-40,60]等結合制備了一系列的納米材料。Huang等[40]在HA上共價連接阿霉素(DOX)，HA-DOX與陽離子型共軛聚合物PFEP通過靜電作用形成納米粒子，同時PFEP的熒光被DOX猝滅。當納米粒子進入HeLa細胞后，HA被透明質酸酶(HAase)降解，因此PFEP熒光被激活，并由此實現對HAase的定量熒光檢測，以及靶向熒光成像和藥物控制釋放。

　　4總結與展望

　　HA具有優異的水溶性、生物相容性，能與多種惡性腫瘤表達的受體特異性結合，可被透明質酸酶降解，并且易于化學修飾，可實現多種超分子弱相互作用力協同工作。人們利用這些優勢特性，能夠通過簡便的方法將HA與各種無機、有機熒光/光聲造影劑結合制備納米材料，提高造影劑的生物相容性，改善化學穩定性和光穩定性，延長在體內循環時間從而增強滲透與保留效應，并能實現對乳腺癌、宮頸癌、肝癌、腦癌、胰腺癌、結腸癌和膀胱癌等腫瘤的主動靶向。

　　另外，利用透明質酸酶對HA的降解實現智能化可激發響應，進一步提高靈敏度和信噪比;而且，還易于同時負載其它類型造影劑或抗癌藥物制備復合納米材料，從而實現FL、PA、NMR、CT或PET成像等多模態靶向成像，以及光熱治療、光動力治療或化療的協同治療功能，顯著提高了細胞乃至活體標記效能和診療效率，減小治療的副作用。因此，該類納米材料具有很好的潛在臨床應用前景。

　　迄今為止，該領域基本還處在實驗室研究階段，仍然存在很大研究空間。新型熒光/光聲造影劑的研究開發方興未艾，靈敏度、穿透性和安全性等性能更好的NIR-II熒光造影劑和光聲造影劑有待進一步開發;為了減少背景噪音、濃度干擾，準確反映影像信號和疾病狀態的實時關系，將造影劑分子設計與HA結合，研制對腫瘤溫度、pH值、還原性物質、活性氧、酶等產生多重可激發智能響應的HA衍生物及其納米材料，將成為今后的重要發展方向。

　　納米材料論文：淺談醫學納米材料的應用與發展

　　然而，該類納米材料要實現臨床轉化，也面臨著很多亟待解決的問題和挑戰。體內研究還處于起步階段，需要進一步探索其與其它生物的系統相互作用，深入研究納米材料的結構、形貌、尺寸等對細胞攝取、造影能力和治療效果的影響，提高體內診療效率;對其在生物體內的分布、生物毒性、體內的降解及排除機理需要進行更系統的評估，獲得長期生物安全、免疫反應和藥物代謝動力學等更全面的體內研究結果,為臨床實際應用提供重要支撐。相信通過化學、材料、生物和醫學多學科領域科研工作者的合作和努力，這類材料可望在臨床診斷和疾病治療上產生重要的應用價值。

　　作者：潘立祥黃艷琴*,盛況張瑞,c范曲立黃維