摘要在大連東港被原油污染的潮間帶篩選出一株能在低溫脅迫下產(chǎn)生物表面活性劑的石油降解菌，命名為DG-1。通過16SrRNA基因測序方法鑒定該菌株為鹽單胞菌。在4℃的低溫下，經(jīng)過15、30、60d的降解培養(yǎng)后，分別有14%、41%和58%的原油被該菌株降解。菌株DG-1可利用柴油和原油為碳源產(chǎn)生物表面活性劑，其中以柴油為唯一碳源時(shí)發(fā)酵液的表面張力可降低至32.4mN/m。薄層色譜和紅外光譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明所產(chǎn)的表面活性劑為糖脂類表面活性劑。

　　關(guān)鍵詞低溫石油降解菌生物降解生物表面活性劑

　　目前還未發(fā)現(xiàn)能完全替代石油的清潔能源[1];但是隨著石油的開采、儲運(yùn)和加工，石油污染對環(huán)境和人類健康的危害越來越大[2]。潮間帶處于海陸生態(tài)交錯區(qū)，生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)價(jià)值巨大但是環(huán)境較為敏感，溢油事故往往對其造成嚴(yán)重危害。如果溢油發(fā)生在寒冷季節(jié)，在低溫脅迫下易揮發(fā)的石油組分蒸發(fā)速率降低，長鏈烷烴的石油烴組分呈不溶狀，從而導(dǎo)致石油污染物持續(xù)存在[3]。

　　此外，低溫也加大了石油污染清除工作的難度。因此發(fā)生在低溫時(shí)的溢油事故往往危害更大。例如ExxonValdez油輪溢油事故污染了約1700km的海岸帶，大量海鳥、海獺和魚類死亡，對周圍環(huán)境的影響一直持續(xù)到現(xiàn)在[4，5]。生物方法具有效率高、費(fèi)用低、不需大型設(shè)備和生態(tài)友好等特點(diǎn)[6]，在清除海岸帶等生態(tài)敏感區(qū)的石油污染時(shí)優(yōu)勢明顯。微生物修復(fù)屬于生物修復(fù)的一種，細(xì)菌結(jié)構(gòu)簡單、適應(yīng)性強(qiáng)，常被用于污染物的微生物修復(fù)[7]。

　　但是在低溫條件下，常溫菌活性降低，而且石油烴的生物可利用性也降低[8]。盡管低溫不利于石油烴的生物降解，但自然界存在能夠降解石油烴的低溫石油降解菌，并且有些低溫菌能夠通過產(chǎn)生物表面活性物質(zhì)來提高對石油烴的利用率[9—11]。目前對產(chǎn)表面活性劑的海洋石油降解菌的研究主要集中在常溫菌，對低溫菌研究的較少，特別是對篩選自海洋環(huán)境的產(chǎn)表面活性劑的低溫菌株研究極少[11，12]。

　　中國北方海區(qū)是重要的石油開發(fā)區(qū)，近年來在冬季發(fā)生多起溢油事故。如“東方大使”輪觸礁事故、“塔斯曼海”油輪碰撞事故、“錦集7”號輪沉船事故等，危害海洋環(huán)境[13—15]。因此，研究低溫時(shí)溢油事故的處理技術(shù)對保護(hù)中國北方海域十分必要。本研究的目的在于中國北方海域篩選能產(chǎn)表面活性劑的低溫石油降解菌并研究其性能。

　　1實(shí)驗(yàn)材料與方法

　　1.1培養(yǎng)基

　　實(shí)驗(yàn)用到兩種培養(yǎng)基:MMC培養(yǎng)基和2216E培養(yǎng)基。

　　1.2方法

　　1.2.1采樣

　　石油污染海水樣品采自位于大連東港商務(wù)區(qū)的一片巖石潮間帶，該區(qū)域被原油污染。取表層水樣裝入無菌廣口玻璃瓶中，帶回實(shí)驗(yàn)室放入冷藏柜4℃保存。

　　1.2.2菌株篩選

　　采用傳統(tǒng)的搖瓶法篩選菌株，培養(yǎng)溫度為4℃，采用原油作為唯一碳源。采用稀釋涂布法將富集液中的細(xì)菌進(jìn)行分離，采用平板劃線法將分離的菌落純化。采用排油圈法挑選產(chǎn)表面活性劑的菌株。

　　1.2.3菌株的生理生化反應(yīng)

　　對所篩選出的菌株進(jìn)行革蘭氏染色和氧化酶實(shí)驗(yàn)、VP實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)和硫化氫產(chǎn)出等生理生化實(shí)驗(yàn)。

　　1.2.416SrRNA基因測序

　　采用16SrRNA基因測序的方法進(jìn)行菌株鑒定。引物為27f(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3')和1492R(5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3')。將引物在6000r/min下離心3min后稀釋100倍。挑取適量菌體置于裝有50μL的PCR裂解緩沖液的離心管中，振蕩混勻，于80℃水浴溫育15min，離心分離，將上清液轉(zhuǎn)至另一離心管進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)步驟:在循環(huán)前進(jìn)行94℃加熱5min，進(jìn)入循環(huán)(30次)94℃停留30s54.5℃停留30s、72℃停留30s、循環(huán)之后72℃停留7min，4℃保持。

　　稱取0.45g瓊脂糖加入到30mLTAE緩沖溶液中，加熱直至瓊脂糖由渾濁變?yōu)槌吻逋该鳌＜尤?0mL于半板，等瓊脂糖緩沖溶液溫度降至40～50℃，加入3μLDNA染色劑。吸取5μLPCR產(chǎn)物放入凝膠托盤孔內(nèi)，電泳30min后放入紫外燈箱內(nèi)觀察是否出現(xiàn)明顯條帶。委托上海立菲生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

　　1.2.5降解性能測定

　　挑取菌體轉(zhuǎn)移至裝有100mL已滅菌2216E液體培養(yǎng)基的瓶錐形中振蕩培養(yǎng)。將5mL菌液加入到含有1mL柴油的100mLMMC培養(yǎng)液中，于4℃下培養(yǎng)分別培養(yǎng)15d、30d、60d。以不接種菌液的培養(yǎng)液作為空白組。降解培養(yǎng)結(jié)束后，在培養(yǎng)液中加入3mL50%的硫酸溶液進(jìn)行酸化。

　　用20mL的石油醚萃取三次。將萃取后的油相采用紫外分光光度法測石油烴含量。降解率D的計(jì)算公式為D=[(C0-C1)/C0]×100%。其中，C0為空白瓶中石油烴的濃度，C1為實(shí)驗(yàn)瓶中石油烴的濃度。采用可見光分光光度計(jì)在600nm的波長下測定發(fā)酵液水相的吸光度。

　　1.2.6產(chǎn)表面活性劑性能測定

　　將菌體轉(zhuǎn)至裝有100mL已滅菌的2216E液體培養(yǎng)基的瓶錐形中，低溫振蕩培養(yǎng)3d(4℃，120r/min)形成降解菌母液。分別利用柴油和原油為碳源，考察菌株產(chǎn)表面活性劑的情況。按照5%的比例將降解菌母液移至已滅菌的MMC液體培養(yǎng)基中，然后分別加入1%的碳源。在4℃條件下低溫振蕩培養(yǎng)30d。以不接種降解菌的培養(yǎng)液作為空白組。

　　降解培養(yǎng)結(jié)束后，發(fā)酵液離心去除菌體后用鹽酸調(diào)節(jié)至pH=2.0，在4℃下冷藏過夜。使用表面張力儀測定發(fā)酵液的表面張力。

　　1.2.7表面活性劑制備與鑒定

　　用氯仿-甲醇(2∶1，體積比)混合液萃取發(fā)酵液中的表面活性劑，將萃取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得到物質(zhì)為生物表面活性劑。將提取的表面活性劑樣品干燥后進(jìn)行紅外光譜分析。另外，也采用薄層層析法鑒定表面活性劑種類。展開劑為V氯仿∶V甲醇∶V水=70∶10∶0.5。將1g蒽酮和5mL濃硫酸溶于95mL乙醇中作為顯色劑。

　　將表面活性劑溶液用毛細(xì)管滴點(diǎn)樣于離薄層板一端1cm處，晾干后置薄層板于盛有展開劑的展開槽內(nèi)，待展開劑上升至離薄層板頂端約1cm附近時(shí)，將色譜板取出，干燥后噴顯色劑，放入95℃烘箱中加熱10min，取出觀察顯色情況。

　　2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

　　2.1菌株的篩選

　　根據(jù)菌落生長速度、菌落數(shù)量和大小、產(chǎn)生的溶解圈直徑大小等條件從分離出的菌株中選出一株優(yōu)勢菌，命名為DG-1。該菌株的菌落呈乳白色、濕潤、圓形、光滑、隆起、邊緣規(guī)則。

　　2.2菌株的生理生化特征

　　菌株DG-1的革蘭氏染色結(jié)果為陰性。氧化酶實(shí)驗(yàn)、VP實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)等生理生化實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

　　2.3菌株鑒定

　　在NCBI網(wǎng)站利用BLAST對菌株的基因序列進(jìn)行對比分析，選取與菌株DG-1親緣相近菌株的序列，通過Mega6軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，菌株DG-1為鹽單胞菌(Halomonas)菌屬的細(xì)菌。

　　2.4降解性能分析

　　在降解培養(yǎng)的初始階段，原油呈黑色薄膜狀漂浮在液面上，水相澄清。隨著降解培養(yǎng)的進(jìn)行，原油油膜分散，部分原油呈油滴狀態(tài)，溶液變渾濁。培養(yǎng)后期，有絮狀物沉淀于瓶底，也有細(xì)小的黑色屑狀物質(zhì)懸浮于溶液中，溶液呈褐色渾濁狀態(tài)。表明原油被菌株DG-1逐步降解。

　　結(jié)果表明，菌株DG-1在4℃的低溫下依然保持活性，能較高效地降解原油。降解的初期原油降解率較低，之后上升較快，30d后原油的降解率趨向于緩慢上升。原油的降解率和溶液中菌株的豐度存在線性關(guān)系，菌株豐度越高則原油降解率越高。

　　2.5產(chǎn)表面活性劑分析

　　在4℃條件下，菌株DG-1利用柴油和原油為碳源進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)30d后，可將發(fā)酵液表面張力分別降低至32.4、53.5mN/m。菌株DG-1所產(chǎn)表面活性劑的紅外光譜實(shí)驗(yàn)。可發(fā)現(xiàn)C—O—C鍵、C—H、CO�呮I的吸收峰，可以推測該生物表面活性劑為糖脂類表面活性劑。此外，薄層層析板上顯現(xiàn)棕色斑點(diǎn)，也說明該表面活性劑為糖脂類表面活性劑。

　　3結(jié)論與展望

　　本研究篩選出一株能在4℃的低溫條件下降解原油的菌株，該菌株在降解原油和柴油的過程中能代謝生物表面活性劑從而提高石油烴的生物利用率。因此，該菌株具有應(yīng)用于中國北方海域冬季溢油原位修復(fù)工作的潛力。本研究的結(jié)果可以為海洋溢油的微生物修復(fù)提供優(yōu)良菌源和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。但論文中很多的研究工作還處于初始階段，未來應(yīng)進(jìn)一步深化研究。

　　參考文獻(xiàn)

　　1VarjaniSJ，RanaDP，JainAK，etal.Synergisticex-situbiodegradationofcrudeoilbyhalotolerantbacterialconsortiumofindigenousstrainsisolatedfromonshoresitesofGujarat，India[J].InternationalBiodeteriorationandBiodegradation，2015，103:116-124

　　2HeadIM，JonesDM，RolingWF，etal.Marinemicroorganismsmakeamealofoil[J].NatureReviewsMicrobiology，2006(4):173-182

　　3AtlasRM.Microbialdegradationofpetroleumhydrocarbons:anenvironmentalperspective[J].ClinicalMicrobiologyReviews，1981，45(1):180-2094PiattJF，LensinkCJ，ButlerW，etal.Immediateimpactofthe“exxonvaldez”oilspillonmarinebirds[J].AmericanUniversityofKuwait，1990，107(2):387-397

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