摘要鄰硝基苯￣β￣D￣吡喃半乳糖苷(ONPG)法和雙糖酶法是常用的乳糖酶活力測(cè)定方法，本文對(duì)這兩種方法的線性范圍、檢出限、精密度、準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示，ONPG法在線性范圍、檢出限、精密度以及穩(wěn)定性方面均優(yōu)于雙糖酶法，但此種方法的重復(fù)性較差，需要進(jìn)一步的優(yōu)化。對(duì)比這兩種方法，可為乳糖酶活力測(cè)定方法的合理選取提供參考。

　　關(guān)鍵詞：鄰硝基苯￣β￣D￣吡喃半乳糖苷法;雙糖酶法;乳糖酶活力測(cè)定;方法學(xué)比較

　　乳糖酶是一種與腹瀉相關(guān)的重要腸道功能酶，乳糖酶活性測(cè)定方法對(duì)乳糖酶缺乏癥的診斷及乳糖酶制劑的活性測(cè)定非常重要。目前，乳糖酶活性定量檢測(cè)方法主要有:雙糖酶法、鄰硝基苯￣β￣D￣吡喃半乳糖苷(ONPG)試驗(yàn)法、穩(wěn)定同位素法、高效液相色譜法及糞便還原糖測(cè)定法[1]。雙糖酶法[2]、ONPG試驗(yàn)法[3]因其試劑組成簡(jiǎn)單、成本低、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)而在實(shí)驗(yàn)室中得到廣泛的應(yīng)用。ONPG法的原理為ONPG在乳糖酶的作用下生成鄰硝基酚(ONP)，ONP在堿性的條件下呈現(xiàn)黃色，可利用紫外￣可見(jiàn)分光光度法(UV￣Vis)在波長(zhǎng)420nm處檢測(cè)。

　　雙糖酶法是臨床采取小腸粘膜樣本進(jìn)行雙糖酶活性測(cè)定的檢測(cè)方法，亦稱(chēng)小腸粘膜活檢法，此種方法測(cè)乳糖酶活力的原理為乳糖在乳糖酶的作用下分解為等量的葡萄糖和半乳糖，葡萄糖在葡萄糖氧化酶作用下釋放出H2O2，后者在過(guò)氧化氫酶作用下使無(wú)色的鄰聯(lián)茴香胺氧化顯紅色，可在420nm處利用UV￣Vis檢測(cè)。本文對(duì)兩種常用乳糖酶測(cè)定方法的線性范圍、檢出限、精密度、重復(fù)性以及穩(wěn)定性進(jìn)行比較，旨在為乳糖酶活性測(cè)定方法提供一定的參考。

　　通過(guò)空白溶液的吸光值(見(jiàn)輔助材料表S1和表S2)和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得ONPG法和雙糖酶法的檢出限(S/N=3)分別為156和170U/g。雙糖酶法在低濃度時(shí)成線性關(guān)系而高濃度偏離線性的原因可能有以下兩點(diǎn):首先，雙糖酶法中所用顯色劑主要是由葡萄糖氧化酶、過(guò)氧化物酶等組成，大部分酶均存在飽和點(diǎn)，即在一定的條件下，當(dāng)所有的酶與底物結(jié)合生成中間產(chǎn)物后，即使再增加底物濃度，中間產(chǎn)物濃度也不會(huì)增加，酶促反應(yīng)速度也不增加[4]，這可能就是雙糖酶法標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定中吸光值不會(huì)隨葡萄糖含量的增加而無(wú)限增加的原因。其次，葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下生成葡萄糖酸和過(guò)氧化氫，當(dāng)體系中H2O2的含量增加時(shí)，部分過(guò)氧化氫被過(guò)氧化物酶分解，這可能導(dǎo)致吸光值隨著葡萄糖含量增加反而有所下降。按兩種方法平行配制6份樣品，每份樣品在相同的條件下測(cè)定10次，結(jié)果見(jiàn)輔助材料表S3與表S4。

　　ONPG法6個(gè)平行樣品酶活10次測(cè)量的RSD分別為0.32%、0.23%、0.23%、0.16%、0.12%和0.33%，平均RSD為0.23%;而雙糖酶法6個(gè)平行樣品酶活10次測(cè)量的RSD分別為0.94%、1.13%、1.36%、1.22%、1.08%和0.68%，平均RSD為1.07%。ONPG法6個(gè)樣品的10次測(cè)量平均值的RSD為7.71%，而雙糖酶法為3.87%。

　　由此可以發(fā)現(xiàn)ONPG法的精密度較好，而重復(fù)性較差，可能原因與ONPG底物溶液不穩(wěn)定有關(guān)[1]，久置可見(jiàn)許多絮狀物，而ONPG底物溶液一般需放置一周后才能使用，這可能是導(dǎo)致ONPG重復(fù)性差的原因。雙糖酶法的重復(fù)性較好，但是精密度較差，可能與反應(yīng)后整個(gè)溶液體系的穩(wěn)定性有關(guān)。鄰苯二茴香胺在95%乙醇中溶解度并不大，能明顯地看到棕褐色細(xì)小的懸浮物存在。這一點(diǎn)從加入曲拉通X￣100中可以得到佐證。

　　曲拉通X￣100為非離子表面活性劑，在UV￣Vis中可用于增加溶液的穩(wěn)定性以及靈敏度[5]。另外葡萄糖被葡萄糖氧化酶氧化生成的葡萄糖酸微溶于乙醇等有機(jī)溶劑[6]，而Tris￣glucoseoxidase(TGO)顯色劑中鄰苯二茴香胺、曲拉通X￣100洗滌液均為95%的乙醇溶液配制，這在一定的程度上解釋了雙糖酶法精密度差的原因。考慮到ONPG法的重復(fù)性較差，故在相同的條件下按兩種方法各配制3份樣品，將3份樣品混合放置不同時(shí)間，分別測(cè)定兩種方法的吸光值。

　　ONPG法所配制的樣品隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)波動(dòng)較小，反映用此種方法所得到的反應(yīng)體系液較為穩(wěn)定。而用雙糖酶法所配制的樣品隨放置時(shí)間的延長(zhǎng)波動(dòng)較大，提示用此種方法測(cè)定乳糖酶活力時(shí)應(yīng)盡早測(cè)定，這樣得到的結(jié)果較為可靠。上述研究表明，ONPG法在線性范圍、檢出限、精密度以及穩(wěn)定性方面均優(yōu)于雙糖酶法，是實(shí)驗(yàn)室乳糖酶活力測(cè)定的首選方法。但由于ONPG底物溶液的不穩(wěn)定性，導(dǎo)致平行樣品之間吸光值偏差較大，需要進(jìn)一步進(jìn)行方法優(yōu)化，例如，可將底物溶液進(jìn)行離心后再統(tǒng)一進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)部分722型紫外￣可見(jiàn)光分光光度計(jì)(UV￣Vis，上海創(chuàng)萌生物科技有限公司)。

　　ONP為分析純?cè)噭?ONPG、葡萄糖氧化酶、過(guò)氧化物酶和二茴香胺均為生物試劑，乳糖酶為食品級(jí)，以上試劑均為市售;三羥甲基氨基甲烷(Tris，生物試劑美國(guó)Amresco公司)，蒸餾水自制。參照文獻(xiàn)[3]，在潔凈的試管中加入1mL5mg/mL樣品酶液，平行制作3份，37℃預(yù)熱后加入1mL20mmol/LONPG底物溶液，置于37℃的恒溫水浴鍋中反應(yīng)10min。隨后加入3mL0.5mol/L的Na2CO3溶液終止反應(yīng)，于420nm處測(cè)定吸光值。

　　空白對(duì)照中樣品酶活事先經(jīng)過(guò)滅活，其它步驟與上述一致。參照文獻(xiàn)[2]，在潔凈的試管中加入0.1mL5mg/mL樣品酶液，預(yù)熱后加入0.1mL0.056mol/L乳糖底物溶液，平行制作3份，于37℃的恒溫水浴鍋中反應(yīng)60min，隨后用蒸餾水補(bǔ)足至1mL，立即置于100℃的沸水中煮沸2min，終止反應(yīng)。待試管冷卻至室溫后，各管加入6mLTGO顯色劑于37℃顯色60min，于420nm處測(cè)定各管的吸光值。空白對(duì)照中樣品酶活事先經(jīng)過(guò)煮沸滅活，其它步驟與上述一致。

　　參考文獻(xiàn)

　　[1]HUIHuaying，HUANGYing，LEIZhidan，etal.ResearchProgressofLactaseActivityDetectionMethod[J].ChineseJMicroecol，2016，28(9):1103￣1106(inChinese).惠華英，黃鶯，雷志丹，等.乳糖酶活性檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2016，28(9):1103￣1106.

　　[2]MesserM，DahlqvistA.AOne￣StepUltramicroMethodfortheAssayofIntestinalDisaccharidases[J].AnalBiochem，1966，14(3):376￣392.

　　[3]LederbergJ.TheBeta￣D￣GalactosidaseofEscherichiaColi，StrainK￣12[J].JBacteriol，1950，60(4):381￣392.

　　[4]YAOWenbing.Biochemistry[M].Beijing:People′sMedicalPublishingHouse，2011:149￣150(inChinese).姚文兵.生物化學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，2011:149￣150.

　　生物方向論文投稿刊物：《中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志》可發(fā)科技核心 是由衛(wèi)生部主管，中華預(yù)防醫(yī)學(xué)會(huì)與大連醫(yī)科大學(xué)主辦的中華預(yù)防醫(yī)學(xué)會(huì)系列刊物之一，是報(bào)道有關(guān)微生態(tài)學(xué)方面內(nèi)容的科技期刊，國(guó)內(nèi)外公開(kāi)發(fā)行，系中華預(yù)防醫(yī)學(xué)會(huì)優(yōu)秀期刊。