摘要 為研究我國凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)商業(yè)苗種的遺傳多樣性特征，于河北、山東、廣東、海南等地采集了6個(gè)有代表性的凡納濱對(duì)蝦品牌苗種，分別命名為黃驊R、東營M、廣州P、廣州Z、海南S和海南Z，以8個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記檢測其遺傳多樣性‍‌‍‍‌‍‌‍‍‍‌‍‍‌‍‍‍‌‍‍‌‍‍‍‌‍‍‍‍‌‍‌‍‌‍‌‍‍‌‍‍‍‍‍‍‍‍‍‌‍‍‌‍‍‌‍‌‍‌‍。 結(jié)果顯示，6個(gè)品牌的凡納濱對(duì)蝦在8個(gè)位點(diǎn)呈現(xiàn)不同程度的多態(tài)性，其平均等位基因數(shù)(Na)、期望雜合度(He)、觀測雜合度(Ho)和多態(tài)信息含量(PIC)分別為4.5~9.5、0.516~0.733、0.346~0.550和0.472~0.700，各品牌遺傳多樣性豐富程度從高到低分別為黃驊R>廣州Z>廣州P>海南Z>東營M>海南S‍‌‍‍‌‍‌‍‍‍‌‍‍‌‍‍‍‌‍‍‌‍‍‍‌‍‍‍‍‌‍‌‍‌‍‌‍‍‌‍‍‍‍‍‍‍‍‍‌‍‍‌‍‍‌‍‌‍‌‍。 哈迪–溫伯格平衡(HWE)檢驗(yàn)顯示，4.17% (2/48)的檢測結(jié)果表現(xiàn)為顯著的偏離(0.01 分子變異方差分析(AMOVA)發(fā)現(xiàn)，12%的變異來自品牌間，24%的變異來自品牌內(nèi)個(gè)體間，其余64%的變異均來自所有品牌個(gè)體。 UPGMA聚類分析結(jié)果顯示，6個(gè)品牌的凡納濱對(duì)蝦聚為2個(gè)明顯的分支，廣州P和廣州Z聚為一支，東營M、黃驊R、海南Z和海南S聚為一支。 主成分分析(PCA)結(jié)果顯示，各品牌凡納濱對(duì)蝦無法單獨(dú)進(jìn)行聚類。 本研究初步分析了當(dāng)前國內(nèi)養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦的遺傳背景，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為凡納濱對(duì)蝦良種選育提供數(shù)據(jù)支撐。

　　關(guān)鍵詞 凡納濱對(duì)蝦; 商業(yè)苗種; 微衛(wèi)星; 遺傳多樣性

　　凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)原產(chǎn)地主要為中、南美的秘魯北部至墨西哥太平洋沿岸，尤其以厄瓜多爾沿岸分布最為密集(王興強(qiáng)等, 2004)。 凡納濱對(duì)蝦為世界三大養(yǎng)殖對(duì)蝦之一(張偉權(quán), 1990)，其產(chǎn)量約占全球?qū)ξr產(chǎn)量的70%(張龍等, 2019)，具有成活率高、食性廣、生長快、適應(yīng)能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。 凡納濱對(duì)蝦于1988年從美國引入，之后迅速在全國范圍內(nèi)普及(于洋, 2014; 唐揚(yáng)等, 2018)，成為我國海水養(yǎng)殖動(dòng)物中養(yǎng)殖發(fā)展最快的一個(gè)種類(馬春艷等, 2011)。 目前，我國已成為世界上凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的國家(頡曉勇等, 2008; 童馨等, 2009)。

　　農(nóng)藝師論文投稿刊物：漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展(雙月刊)是由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所和中國水產(chǎn)學(xué)會(huì)主辦、國內(nèi)外公開發(fā)行的學(xué)術(shù)期刊。

　　隨著我國凡納濱對(duì)蝦市場需求量的增大，對(duì)蝦苗種培育方式也出現(xiàn)了轉(zhuǎn)變。 目前，在集約化苗種培育技術(shù)已達(dá)峰值的背景下，有些育苗場為了進(jìn)一步降低成本，種蝦不經(jīng)選育，長期近交繁殖，隨著養(yǎng)殖產(chǎn)量的增大，隨之而來的問題也越來越多。 最大的問題莫過于養(yǎng)殖對(duì)蝦遺傳多樣性下降，加之外來親本得不到更新，國內(nèi)養(yǎng)殖對(duì)蝦出現(xiàn)了種質(zhì)退化、病害暴發(fā)頻繁的現(xiàn)象。 從長遠(yuǎn)角度來看，查清我國凡納濱對(duì)蝦遺傳背景，對(duì)進(jìn)一步培育優(yōu)良品種和促進(jìn)可持續(xù)健康養(yǎng)殖具有重要指導(dǎo)意義。

　　分子標(biāo)記目前已廣泛運(yùn)用于水產(chǎn)動(dòng)物育種中(張瓊等, 2011; 孫苗苗等, 2017; 王軍等, 2018)，其中，又以微衛(wèi)星(Microsatellite或Simple Sequence Repeats)分子標(biāo)記應(yīng)用最為普遍。 微衛(wèi)星標(biāo)記是2~6個(gè)堿基為核心的短串聯(lián)重復(fù)序列，重復(fù)單位的重復(fù)次數(shù)在個(gè)體間呈高度變異性且數(shù)量豐富，分布于生物體整個(gè)基因組中(Tautz, 1989; Schl? tterer et al, 1992)。 微衛(wèi)星標(biāo)記具有多態(tài)性高、重復(fù)性好、操作簡單、共顯性遺傳等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于對(duì)蝦群體遺傳多樣性分析(Bringmann et al, 1996; Postlethwait et al, 1998; 張?zhí)鞎r(shí)等, 2005; 曾地剛等, 2008)。 本研究利用8個(gè)擴(kuò)增穩(wěn)定的微衛(wèi)星位點(diǎn)，對(duì)國內(nèi)6個(gè)商業(yè)品牌凡納濱對(duì)蝦苗種進(jìn)行遺傳多樣性分析，初步分析當(dāng)前國內(nèi)養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦的遺傳背景，為凡納濱對(duì)蝦優(yōu)良品種的選育提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

　　1 材料與方法

　　1.1 實(shí)驗(yàn)材料

　　選用我國有代表性的6個(gè)品牌凡納濱對(duì)蝦商業(yè)苗種[平均體長為(49.73±1.53) mm，平均體重為(1.41± 0.11) g]，分別命名為黃驊R、海南Z、海南S、廣州Z、廣州P和東營M。 每個(gè)品牌取30尾個(gè)體進(jìn)行肌肉組織DNA提取，共計(jì)180尾凡納濱對(duì)蝦個(gè)體。

　　1.2 實(shí)驗(yàn)方法

　　采用天根海洋動(dòng)物組織DNA提取試劑盒進(jìn)行肌肉組織DNA提取，利用紫外分光光度計(jì)(BioImaging ystems, UVP)進(jìn)行DNA濃度測量，并根據(jù)測量結(jié)果將DNA稀釋至50 ng/μl。 將稀釋得到的DNA利用 8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 PCR反應(yīng)體系：總體積為20 μl，其中，模板DNA 1.5 μl，(Vazyme) 2 × Taq Master Mix (Dye Plus) 10 μl，正向和反向引物 (10 mmol/L)各0.8 μl，滅菌超純水6.9 μl。 PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min; 95℃變性30 s; 72℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán); 72℃延伸5 min; 4℃保存。 PCR產(chǎn)物微衛(wèi)星分型于生工生物工程(上海)股份有限公司，利用ABI 3730XL測序儀完成。

　　1.3 數(shù)據(jù)處理

　　對(duì)6個(gè)品牌凡納濱對(duì)蝦商業(yè)苗種進(jìn)行哈迪–溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium, HWE)檢測和遺傳多樣性分析。 利用GENEPOP version 3.4軟件進(jìn)行HWE檢驗(yàn)，得到精確P值(PH-W)。 通過Cervus 3.0計(jì)算各位點(diǎn)的等位基因數(shù)目(Number of alleles, Na)，觀測雜合度(Observed heterozygosities, Ho)、期望雜合度(Expected heterozygosities, He)、8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)信息含量(Polymorphism information content, PIC)和無效等位基因頻率[Null alleles frequency, F(Null)]。

　　利用GenAlEx 6.51軟件計(jì)算6個(gè)品牌凡納濱對(duì)蝦在各位點(diǎn)的香農(nóng)多樣性指數(shù)(Shannon's diversity index)、8個(gè)位點(diǎn)每個(gè)品牌特有等位基因(Private alleles)平均值、各品牌間的遺傳分化程度和基因流(包括總的FST值以及兩兩品牌間的FST值); 分子變異方差分析(Analysis of molecular variance, AMOVA)，估測遺傳變異在品牌內(nèi)和品牌間的分配情況; 6個(gè)品牌間Nei’s無偏遺傳距離、遺傳相似性系數(shù)、品牌間遺傳距離矩陣、個(gè)體間遺傳距離矩陣; 利用品牌間和個(gè)體間遺傳距離矩陣進(jìn)行主成分分析(Principal coordinate analysis, PCA)。 利用NTSYSpc 2.1軟件按照遺傳一致度進(jìn)行6個(gè)品牌凡納濱對(duì)蝦UPGMA聚類。

　　2 結(jié)果

　　2.1 6個(gè)商業(yè)品牌凡納濱對(duì)蝦苗種遺傳多樣性分析

　　在8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中，6個(gè)品牌凡納濱對(duì)蝦總等位基因數(shù)為36~76個(gè)，最大為黃驊R，最小為東營M。 各品牌平均等位基因數(shù)為4.5~9.5個(gè)。 黃驊R平均每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)存在1.625個(gè)特有等位基因，在所有品牌中最多。 東營M平均每個(gè)位點(diǎn)存在0.125個(gè)特有等位基因，為各品牌中最少。 8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)信息含量(PIC)值為0.343~0.925，最高為TuMXLv7.56位點(diǎn)，最低為M1103位點(diǎn)，除M1103位點(diǎn)外，其他7個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)PIC都大于0.5。 黃驊R、廣州Z和海南Z的香農(nóng)多樣性指數(shù)較高，其他3個(gè)品牌較低。 8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的無效等位基因頻率范圍為0.031~0.403，5個(gè)位點(diǎn)存在無效等位基因。 8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)分別對(duì)6個(gè)品牌凡納濱對(duì)蝦進(jìn)行了48次HWE檢驗(yàn)。 其中，4.17%(2/48)的檢測結(jié)果表現(xiàn)為顯著的偏離(0.01 0.05)。

　　2.2 6個(gè)商業(yè)品牌凡納濱對(duì)蝦的遺傳分化

　　分子變異方差分析(AMOVA)發(fā)現(xiàn)，僅有12%的遺傳變異來自品牌間，24%來自品牌內(nèi)個(gè)體間，其余64%的變異均來自所有品牌個(gè)體，這表明遺傳變異主要存在于個(gè)體間。

　　6個(gè)品牌凡納濱對(duì)蝦商業(yè)苗種的F統(tǒng)計(jì)量分別為0.359 (FIT)，0.273 (FIS)，0.118 (FST)。 兩兩品牌間的值FST在0.034和0.111之間，均 <0.15，且明顯的分成兩部分。其中，小于0.05的為4組，占全部15組的26.67%，沒有出現(xiàn)遺傳分化(FST <0.05);介于0.05和0.15之間的為11組，占全部15組的73.33%，為中等程度分化(0.05 另外，從基因流分布情況來看，兩兩群體間Nm>1，范圍為1.806~7.027。

　　2.3 6個(gè)商業(yè)品牌凡納濱對(duì)蝦的遺傳聚類

　　東營M和海南Z品牌間的遺傳距離最近(0.128)，遺傳相似性系數(shù)最大(0.880)，親緣關(guān)系最近; 廣州P和海南S品牌間的遺傳距離最遠(yuǎn)(0.549)，遺傳相似性系數(shù)最小(0.578)，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。 6個(gè)品牌的凡納濱對(duì)蝦聚為2個(gè)明顯的分支，廣州P和廣州Z聚為一支，東營M、黃驊R、海南Z和海南S聚為一支。

　　2.4 6個(gè)商業(yè)品牌凡納濱對(duì)蝦遺傳關(guān)系主成分分析

　　主成分分析(PCA)結(jié)果顯示，6個(gè)品牌凡納濱對(duì)蝦商業(yè)苗種產(chǎn)生了明顯的遺傳歧化。 其中，廣州P和廣州Z最為聚集，其次為東營M和海南Z，之后為黃驊R和海南S，主成分1 (Coord.1)和主成分2 (Coord.2)共解釋了總遺傳變異的71.22%‍‌‍‍‌‍‌‍‍‍‌‍‍‌‍‍‍‌‍‍‌‍‍‍‌‍‍‍‍‌‍‌‍‌‍‌‍‍‌‍‍‍‍‍‍‍‍‍‌‍‍‌‍‍‌‍‌‍‌‍。 在個(gè)體水平上，主成分1 (Coord.1)和主成分2 (Coord.2)共解釋了總遺傳變異的20.05%。 6個(gè)品牌的180尾凡納濱對(duì)蝦個(gè)體聚集較為集中，其中，廣州P、廣州Z和黃驊R 3個(gè)品牌的凡納濱對(duì)蝦交集最大。 同時(shí)，每個(gè)品牌的凡納濱對(duì)蝦個(gè)體無法單獨(dú)聚為一類。

　　3 討論

　　微衛(wèi)星分子標(biāo)記在種內(nèi)有高度的遺傳變異，是群體遺傳分化分析的有效標(biāo)記(孫效文等, 2008)。 微衛(wèi)星分子標(biāo)記廣泛分布于基因組中，數(shù)量眾多，容易檢測，在分子輔助育種和物種多樣性檢測等方面被廣泛應(yīng)用(張麗娟等, 2014)。 群體的遺傳多樣性來源于物種適應(yīng)復(fù)雜環(huán)境和生存進(jìn)化(Li et al, 2016)，其主要表現(xiàn)在等位基因數(shù)的豐富和均勻程度、遺傳雜合度的大小、多態(tài)信息含量的高低3個(gè)方面(Beardmore et al, 1997; 王鶴等, 2016)。

　　研究發(fā)現(xiàn)，等位基因越豐富，遺傳雜合度數(shù)值越大，多態(tài)信息含量越高，則群體遺傳變異更高，更能應(yīng)對(duì)環(huán)境變化，也更能產(chǎn)生優(yōu)質(zhì)的種質(zhì)資源(Eschenroeder et al, 2016)。關(guān)于凡納濱對(duì)蝦微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)和篩選的工作已有大量報(bào)道(Meehan, et al, 2003; 馬寧等, 2013; 楊銘等, 2017)。 本研究從實(shí)驗(yàn)室發(fā)表過的文章(李東宇等, 2016)中篩選出8個(gè)擴(kuò)增穩(wěn)定的微衛(wèi)星位點(diǎn)，分析了6個(gè)國內(nèi)品牌的凡納濱對(duì)蝦商業(yè)苗種的遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系。 結(jié)果顯示，87.5% (7/8)的位點(diǎn)平均多態(tài)信息含量(PIC)都在0.5以上。

　　根據(jù)Botstein等(1980)提出的衡量標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)PIC>0.5時(shí)，意味著該位點(diǎn)為高度多態(tài)位點(diǎn)，這也說明本研究所引用的微衛(wèi)星標(biāo)記的多態(tài)性較高。 基因雜合度是衡量群體遺傳變異水平的理想?yún)��?shù)(王日芳等, 2017)，8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中的觀測雜合度(Ho)平均為0.486，期望雜合度(He)平均為0.745，觀測雜合度小于期望雜合度，也從一個(gè)側(cè)面說明了國內(nèi)商業(yè)苗種凡納濱對(duì)蝦出現(xiàn)了雜合子缺失、純合子過剩的情況。

　　在進(jìn)行微衛(wèi)星分型的8個(gè)位點(diǎn)中，有5個(gè)(62.5%)位點(diǎn)顯著偏離HWE (P <0.05)。產(chǎn)生該結(jié)果的原因：一方面為實(shí)驗(yàn)對(duì)蝦純合子過剩、雜合子缺失; 另一方面為水產(chǎn)動(dòng)物生物結(jié)構(gòu)較為簡單，從而導(dǎo)致的遺傳變異度也較高。 因此，造成微衛(wèi)星位點(diǎn)在同一物種不同個(gè)體中發(fā)生堿基形態(tài)和數(shù)目的變異，無法擴(kuò)增正確的等位基因，擴(kuò)增的無效等位基因會(huì)導(dǎo)致分型結(jié)果顯著偏離HWE (舒妙安等, 2011; 宋忠魁等, 2013)。

　　親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近可以用遺傳距離來反映(陳子桂等, 2016; 劉洪濤等, 2018)。 在本研究中，遺傳距離最大的2個(gè)品牌是廣州P和海南S，遺傳距離最小的2個(gè)品牌是東營M和海南Z，并且針對(duì)個(gè)體的遺傳關(guān)系主成分分析(PCA)表明，6個(gè)品牌的凡納濱對(duì)蝦無法依照每個(gè)品牌單獨(dú)聚集，品牌間親緣關(guān)系較為接近。 這種結(jié)果表明，當(dāng)前國內(nèi)不同品牌的凡納濱對(duì)蝦來源存在一定的相似性，也可能是二代、三代苗種導(dǎo)致部分品牌對(duì)蝦出現(xiàn)近交情況，使其親緣關(guān)系逐漸接近。

　　種苗處于對(duì)蝦產(chǎn)業(yè)鏈上游，其質(zhì)量對(duì)養(yǎng)殖成敗起關(guān)鍵作用(黃小帥等, 2019)。 本研究所分析的6個(gè)品牌凡納濱對(duì)蝦商業(yè)苗種中，黃驊R與廣州Z具有較高的遺傳多樣性，不同品牌的商業(yè)苗種間的遺傳特征存在一定差異。 在當(dāng)前凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大的情況下，研究遺傳因素與養(yǎng)殖生產(chǎn)性能之間的關(guān)聯(lián)尤為重要，只有充分掌握對(duì)蝦群體的遺傳背景，才能合理利用雜交優(yōu)勢進(jìn)行良種選育。

　　作者：方振朋1,2 孟憲紅2① 李旭鵬2 欒 生2 曹家旺2 陳寶龍2 孔 杰2 閆茂倉3 胡利華3