摘要：目的：充分利用野生栽秧泡資源，解決栽秧泡不易貯藏和運(yùn)輸?shù)膯栴}，提高其附加值。方法：以野生栽秧泡果實(shí)為原料，葡萄酒-果酒專用酵母為菌種，優(yōu)化栽秧泡果酒發(fā)酵工藝，并采用頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(HS-SPME-GC-MS)分析栽秧泡果酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類及相對(duì)含量。結(jié)果：栽秧泡果酒最適發(fā)酵條件為：酵母接種量0.7%，主發(fā)酵溫度30℃，初始糖濃度25%，初始pH3.9。在此發(fā)酵條件下的果酒感官評(píng)分為92.10分，各項(xiàng)理化指標(biāo)分別為：酒精度數(shù)11.46%vol，總糖3.89g/L，總酸13.04g/L，可溶性固形物7.64°Bx，pH4.37;分析并鑒定出24種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中醇類、酯類和酸類物質(zhì)占總揮發(fā)性物質(zhì)的79.29%，是構(gòu)成栽秧泡果酒揮發(fā)性風(fēng)味成分的主要基礎(chǔ)物質(zhì)。結(jié)論：研究結(jié)果填補(bǔ)栽秧泡果酒發(fā)酵工藝上的研究空白，為其果酒的規(guī)模化生產(chǎn)提供參考。

　　關(guān)鍵詞：栽秧泡果酒;發(fā)酵工藝;感官評(píng)價(jià);揮發(fā)性化合物

　　栽秧泡(Rubusellipticusvar.obcordatus)是薔薇科(Rosaceae)懸鉤子屬(Rubus)空心莓組植物[1]，在我國西南多省海拔300～2000m區(qū)域有分布，果實(shí)呈黃色，酸甜可口，含有豐富的可溶性糖、維生素、蛋白質(zhì)和氨基酸等，是一種極具經(jīng)濟(jì)價(jià)值但有待開發(fā)的野生小漿果[2]。然而，主干具爪、葉背具毛刺等特征，使得栽秧泡機(jī)械采收困難;果實(shí)成熟期季節(jié)性強(qiáng)且與雨季重疊、果實(shí)無毛易破損等特性，加大了栽秧泡果實(shí)貯藏運(yùn)輸?shù)碾y度[1，3];所以栽秧泡多以鮮果的形式在分布區(qū)周圍小范圍上市，嚴(yán)重限制了栽秧泡相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。果酒的開發(fā)不僅可以一定程度上緩解栽秧泡貨架期短和運(yùn)輸?shù)睦щy，而且能夠解決季節(jié)性成熟導(dǎo)致的浪費(fèi)，同時(shí)果酒還能保留栽秧泡特有的營養(yǎng)成分和果香，創(chuàng)造良好的經(jīng)濟(jì)效益[4-5]。果酒是以水果為原料，通過發(fā)酵將水果或果汁中的糖分代謝后得到的低酒精度營養(yǎng)保健型酒[6]。

　　發(fā)酵論文范例：獼猴桃茶酒的發(fā)酵工藝研究

　　其口感溫和、滋味獨(dú)特、營養(yǎng)價(jià)值高，深受消費(fèi)者青睞。因此，不斷有研究者探討果酒發(fā)酵過程中酵母種類、發(fā)酵時(shí)間、初始糖度、初始pH、溫度等參數(shù)對(duì)發(fā)酵進(jìn)程和發(fā)酵產(chǎn)物的影響，以期能夠得到健康、營養(yǎng)、美味的各類果酒[7-9]。小漿果釀造果酒是目前研究的熱點(diǎn)[4，9-11]，但對(duì)于栽秧泡果酒釀制工藝卻仍然缺乏研究。本研究以栽秧泡果實(shí)為原料，探討酵母接種量、主發(fā)酵溫度、初始糖濃度、初始pH等因素對(duì)栽秧泡果酒的酒精度數(shù)、總酸、可溶性固形物、pH的影響，并采用頂空-固相微萃取(headspacesolidphasemicroextraction，HS-SPME)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gaschromatographymassspectrometry，GC-MS)儀對(duì)最優(yōu)發(fā)酵工藝下栽秧泡果酒的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，以期能為野生小漿果果酒的生產(chǎn)提供借鑒。

　　1材料與方法

　　1.1材料與試劑

　　野生栽秧泡：采自云南省保山市隆陽區(qū)附近山林，挑選無病、無蟲、無害、成熟度高的新鮮栽秧泡鮮果裝入密封袋中，-20℃貯藏，用前12h置于室溫自然解凍;葡萄酒-果酒專用酵母(Saccharomycescerevisiae)、果膠酶(40000U/g)：帝伯仕酵母有限公司;白沙糖、礦泉水、檸檬酸、食用堿：市售(均為食品級(jí));氫氧化鈉、鹽酸、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、苯酚、硫酸、酒石酸、無水乙醇、酚酞、亞硫酸氫鈉均為分析純。

　　1.2儀器與設(shè)備

　　GXZ-30溫培養(yǎng)箱：寧波東南儀器有限公司;JYL-C012榨汁機(jī)：九陽股份有限公司;SWCJZD無菌接種臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司;TDL.5A離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器有限公司;UV-2600紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司;PHS-3CpH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;JK-119手持式折射儀：北京金科利達(dá)電子科技有限公司;手持折光儀：邦西儀器科技(上海)有限公司;頂空固相微萃取裝置(SPME手柄、50/30μmDVB/CAR/PDMS萃取頭)：美國Supelco公司;TRACE1300+ISQGC-MS聯(lián)用儀：賽默飛世爾科技公司。

　　1.3方法

　　1.3.1栽秧泡果酒釀造工藝

　　將自然解凍后的栽秧泡果實(shí)用榨汁機(jī)榨汁后，按照酶解→過濾→調(diào)整果汁成分→滅菌→接種→主發(fā)酵→后發(fā)酵→離心(澄清)等步驟[12-13]制得栽秧泡果酒。操作要點(diǎn)：葡萄酒-果酒專用酵母以1∶10的比例溶解于2%的蔗糖水溶液中，32℃活化30min。按果汁總質(zhì)量的0.02%加入果膠酶攪拌均勻，于室溫下酶解3.0h;以四層紗布過濾酶解后的果汁;添加160mg/L亞硫酸氫鈉[14]，根據(jù)單因素加入白砂糖調(diào)整果汁的初始糖度，用檸檬酸或食用堿調(diào)整果汁的初始pH;75℃水浴鍋中恒溫滅菌15min[14]。冷卻后，按單因素接種活化好的酵母，在試驗(yàn)溫度下主發(fā)酵12d(預(yù)實(shí)驗(yàn)表明12d以后，殘?zhí)橇康陀?.4%)。將主發(fā)酵后的果酒轉(zhuǎn)移至28℃培養(yǎng)箱中，恒溫發(fā)酵30d。澄清：離心機(jī)3500r/min離心3min，上清液即為待測(cè)栽秧泡果酒。

　　1.3.2栽秧泡果酒發(fā)酵單因素試驗(yàn)

　　四個(gè)因素設(shè)定為：酵母接種量0.6%、主發(fā)酵溫度26℃，初始糖濃度23%，初始pH4.3下主發(fā)酵12d，28℃后發(fā)酵30d;固定其中3個(gè)因素，依次探討：酵母接種量(0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%)、主發(fā)酵溫度(18℃、22℃、26℃、30℃、34℃)、初始糖濃度(19%、21%、23%、25%、27%)、初始pH(3.5、3.9、4.3、4.7、5.1)對(duì)果酒精度、酒總酸、可溶性固形物、pH的影響。

　　1.3.3正交試驗(yàn)

　　結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，以酵母接種量、發(fā)酵溫度、初始糖濃度、初始pH為因素，4個(gè)因素3個(gè)水平設(shè)計(jì)并進(jìn)行L(934)正交試驗(yàn)，優(yōu)化發(fā)酵工藝，其余步驟相同。

　　1.3.4測(cè)定方法

　　pH、酒精度的測(cè)定采用GB/T15038-2006《葡萄酒、果酒通用的分析方法》進(jìn)行[15];總糖的測(cè)定和標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制[16]，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.986x-0.0023，R2=0.9998;可溶性固形物、總酸(以酒石酸計(jì))的測(cè)定則根據(jù)NY/T1508-2017《綠色食品果酒》進(jìn)行[16];感官評(píng)價(jià)法：挑選10位選修過《感官評(píng)價(jià)》課程的食品質(zhì)量與安全專業(yè)學(xué)生作為品嘗者(5男5女)，對(duì)每一批果酒進(jìn)行感官評(píng)定，品評(píng)杯為統(tǒng)一的玻璃酒杯，樣品隨機(jī)放置。品評(píng)者分別從色澤、香氣、口感及狀態(tài)方面對(duì)樣品打分，評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)參照國家標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行[15]。

　　果酒揮發(fā)性物質(zhì)檢測(cè)交由昆明理工大學(xué)分析測(cè)試中心進(jìn)行，程序和參數(shù)參考曾朝珍等[17]的研究進(jìn)行設(shè)定：頂空進(jìn)樣，將1mL酒樣與1mL甲醇混勻后加入50μL3-辛醇內(nèi)標(biāo)(630.8ppm)和100μL乙酸正戊酯內(nèi)標(biāo)(219.35ppm)，漩渦震蕩后取1mL置于氣相色譜瓶中自動(dòng)進(jìn)樣。氣相色譜條件為：250℃進(jìn)樣口溫度，載氣為氦氣，流速為1.2mL/min，進(jìn)樣量為1μL，不分流。色譜升溫程序?yàn)椋?0℃恒溫2min，5℃/min升溫至180℃，15℃/min速度升至250℃，保持5min。MS條件：EI電離子源，電子能量70eV，離子源溫度為200℃，接口溫度為250℃。掃描范圍33.00～350.00amu。揮發(fā)性物質(zhì)分析：化合物經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索，與美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院(NationalInstituteofStandardsandTechnology，NIST)的譜庫相匹配，并分析可能屬于栽秧泡果酒的風(fēng)味物質(zhì)，取匹配度≥80%的組分;峰面積歸一化法計(jì)算各揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)百分含量。

　　1.4實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及分析采用Excel2016統(tǒng)計(jì)和作圖，通過SPSS16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

　　2結(jié)果與分析

　　2.1單因素試驗(yàn)

　　2.1.1酵母接種量對(duì)栽秧泡酒發(fā)酵效果的影響

　　栽秧泡果酒的酒精度數(shù)隨著酵母接種量的增加，呈現(xiàn)緩慢增大后迅速減小的趨勢(shì);葡萄酒-果酒專用酵母接種量過高或者過低都不利于釀酒酵母的發(fā)酵進(jìn)程。接種量為0.4%時(shí)酒精度數(shù)最低為7.83±0.71%vol，可能是過多的酵母在生長階段消耗了果汁中的大部分糖，導(dǎo)致酒精發(fā)酵階段沒有足夠的糖可以被分解，從而影響了酒精含量。酵母接種量為0.7%時(shí)酒精度數(shù)最高，為10.30±0.05%vol，此時(shí)栽秧泡果酒的總酸為16.77±3.59g/L，可溶性固形物為7.17±0.13°Bx，pH為3.29±0.11。綜合考慮選酵母接種量為0.6%、0.7%、0.8%進(jìn)行正交試驗(yàn)。

　　2.1.2主發(fā)酵溫度對(duì)栽秧泡酒發(fā)酵效果的影響

　　在主發(fā)酵溫度為30℃時(shí)栽秧泡果酒酒精度和可溶性固形物均為最高，分別為10.05±0.06%vol和7.07±0.25°Bx;此時(shí)果酒的pH最低，為3.38±0.01。酒精度數(shù)隨著主發(fā)酵 溫度的升高總體呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，在主發(fā)酵溫度為18℃時(shí)酒精度數(shù)最低，僅為8.71±0.09%vol。綜合考慮以主發(fā)酵溫度為26℃、30℃、34℃進(jìn)行正交試驗(yàn)。

　　3結(jié)論與討論

　　3.1結(jié)論

　　本研究以栽秧泡果實(shí)為實(shí)驗(yàn)材料，以其果汁為發(fā)酵原液，通過單因素結(jié)合正交試驗(yàn)的方式對(duì)影響其果酒發(fā)酵的因素進(jìn)行探討并優(yōu)化發(fā)酵工藝。確定了栽秧泡果酒的最適發(fā)酵條件為：酵母接種量0.7%，主發(fā)酵溫度30℃，初始糖濃度25%，初始pH3.9，在此條件下住發(fā)酵12d以后，轉(zhuǎn)入28℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行30d后發(fā)酵，所得栽秧泡果酒感官評(píng)分為92.10分，果酒酒精度數(shù)為11.46%vol，總糖3.89g/L，總酸13.04g/L，可溶性固形物7.64°Bx，pH為4.37;此時(shí)酒體呈金黃色，有淡淡的栽秧泡香，酸甜可口;栽秧泡果酒中相對(duì)含量較高的為醇類、酯類和酸類物質(zhì)，共占總揮發(fā)性物質(zhì)的79.29%，是構(gòu)成栽秧泡果酒揮發(fā)性風(fēng)味成分的主要基礎(chǔ)物質(zhì)。

　　3.2討論

　　酵母接種量、主發(fā)酵溫度、初始糖濃度和初始pH是影響果酒發(fā)酵的重要因素之一。酵母接種量不夠時(shí)，酵母生長緩慢，發(fā)酵速度低，果酒易受雜菌感染;酵母接種過多則生長繁殖階段消耗了果汁中的大部分糖，導(dǎo)致發(fā)酵階段沒有足夠的糖可以被分解，從而影響了酒精含量。主發(fā)酵溫度過低會(huì)抑制代謝有關(guān)的酶的活性，導(dǎo)致酵母對(duì)糖的利用率不高，發(fā)酵產(chǎn)酒速率較慢，甚至發(fā)酵不徹底;主發(fā)酵溫度過高則發(fā)酵反應(yīng)劇烈、酵母衰老速度加快、腐敗微生物快速生長發(fā)育，致使果酒酒精度數(shù)下降[17]。

　　果汁中的糖分被分解為酒精等物質(zhì)，適合的初始糖濃度在一定程度上能使酵母菌保持良好的繁殖和代謝速率[19];初始糖濃度過高則會(huì)影響酵母的生長繁殖[18]，同時(shí)過高的初始糖濃度還會(huì)增加發(fā)酵成本。果酒中的揮發(fā)性物質(zhì)與果汁本身的揮發(fā)性物質(zhì)和發(fā)酵過程中 微生物的代謝有關(guān)[20]。不同的發(fā)酵工藝參數(shù)則會(huì)導(dǎo)致代謝物的差異[21-22]。

　　目前，沒有懸鉤子果酒發(fā)酵專用酵母，現(xiàn)行的果酒發(fā)酵流程和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)也多以葡萄酒為參考。本研究未涉及菌種、后發(fā)酵時(shí)間、后發(fā)酵溫度等同樣會(huì)影響果酒品質(zhì)的因素。如今有多種方法可以對(duì)果酒中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行提取和檢測(cè)：頂空-液相微萃取、頂空-固相微萃取、同時(shí)蒸餾萃取法、GC-MS、GC-FID等[19，23]。本研究采用的頂空固相(微)萃取因需樣量小、重復(fù)性好、方便快捷等優(yōu)點(diǎn)被廣泛用于果酒揮發(fā)性物質(zhì)的研究[9]。研究結(jié)果一定程度上填補(bǔ)了栽秧泡果酒發(fā)酵工藝的研究空白，為其果酒的規(guī)模化生產(chǎn)提供了參考。

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　　作者：宋志姣，周藝垠，郭燕，李悅，章金龍，李曉嬌*