摘要分子生藥學(xué)是在分子水平上研究生藥的分類與鑒定、栽培與保護(hù)及有效成分生產(chǎn)的一門科學(xué)，分子生藥學(xué)的提出讓生藥的研究從微觀向基因水平邁進(jìn)。葛根作為藥食兩用植物，具有很高的應(yīng)用價值和經(jīng)濟(jì)價值，品種眾多容易造成混亂且根據(jù)傳統(tǒng)的鑒定方法不易區(qū)分鑒別、且葛根在基因水平上的研究尚淺，因此分子生藥學(xué)對葛根的研究得到學(xué)者的廣泛關(guān)注。該文綜述了近年來分子生藥學(xué)在葛根分子鑒定、轉(zhuǎn)錄組測序研究、葛根功能基因的克隆和合成等方面的研究，以期為進(jìn)一步推動葛根及其有效成分的開發(fā)和利用提供參考。

　　關(guān)鍵詞葛根;分子生藥學(xué);基因;分子標(biāo)記

　　葛根為豆科葛屬植物葛Puerarialobata(Willd.)Ohwi(習(xí)稱野葛)的干燥根，具有解肌退熱，生津止渴，透疹，升陽止瀉，通經(jīng)活絡(luò)，解酒毒等功效[1]。在現(xiàn)行《中國藥典》中收錄了2個葛屬植物品種：葛根和粉葛，但是在2005年版藥典之前未將兩者分開，均作為葛根使用。葛根是中國衛(wèi)生部首批批準(zhǔn)的藥食兩用植物，素有“北參南葛”、“亞洲人參”之美譽(yù)，具有很高的應(yīng)用價值和經(jīng)濟(jì)價值。葛根在化學(xué)成分、藥理藥效機(jī)制和配伍臨床應(yīng)用等方面的研究已較為深入，隨著后基因組時代的來臨，分子技術(shù)的不斷進(jìn)步，葛根在分子層面上的相關(guān)研究逐步被報(bào)道。本文綜述了近年來分子生藥學(xué)在葛根分子鑒定、轉(zhuǎn)錄組測序、葛根功能基因的克隆和合成研究等方面的研究，以期為進(jìn)一步推動葛根及其有效成分的開發(fā)和利用提供參考。

　　1分子鑒定研究

　　分子鑒定是根據(jù)植物的親緣關(guān)系來鑒別，親緣關(guān)系越近，基因遺傳相似度越高。葛屬植物因其品種多，性狀表達(dá)多樣化，研究者根據(jù)傳統(tǒng)的性狀、顯微和簡單的理化鑒別不易區(qū)分，因此，隨著分子技術(shù)的發(fā)展，已有多種分子鑒定方法被報(bào)道在葛屬植物中使用。

　　1.1分子標(biāo)記技術(shù)

　　DNA分子標(biāo)記技術(shù)是以生物個體間遺傳信息的核苷酸差異為基礎(chǔ)的標(biāo)記技術(shù)，是在DNA水平遺傳多態(tài)性的直接反應(yīng)，進(jìn)而揭示生物內(nèi)在基因的排布規(guī)律及其表型性狀的表現(xiàn)規(guī)律。DNA分子標(biāo)記的優(yōu)勢在于：不受外界環(huán)境、發(fā)育階段的影響;在生物生長發(fā)育各個階段、各個組織均能檢測到;標(biāo)記位點(diǎn)分布廣泛，數(shù)量眾多;④表現(xiàn)為顯性或共顯性，有利于對隱性基因的選擇;⑤許多分子標(biāo)記技術(shù)能提供較為完整的遺傳信息，可區(qū)分植物個體的純合子和雜合子基因型[2-4]。分子標(biāo)記以其獨(dú)特的優(yōu)勢，并且操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確性高，特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛的用于遺傳多樣性分析、遺傳圖譜的構(gòu)建、種質(zhì)資源鑒定與分類，分子輔助育種[5]等領(lǐng)域。

　　常用的分子標(biāo)記技術(shù)有：RFLP(限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性)、AFLP(擴(kuò)增限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性)、RAPD(隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性)、ISSR(簡單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性)、SSR(簡單重復(fù)序列)、SRAP(相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性)、SNP(單核苷酸多態(tài)性)、SCoT(目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性)、DNA條形碼分析技術(shù)等[6-8]。

　　1.1.1RAPD分子標(biāo)記

　　隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(randomamplifiedpolymorphicDNA，RAPD)標(biāo)記技術(shù)是1990年美國學(xué)者Williams和Welsh2個研究團(tuán)隊(duì)同時發(fā)展起來的。RAPD標(biāo)記的分離情況符合孟德爾遺傳規(guī)律，可作為一種有效的分子標(biāo)記技術(shù)。因其操作簡單、實(shí)驗(yàn)成本低、所需DNA量極少、檢測效率高等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于親緣關(guān)系與種質(zhì)資源多樣性研究、構(gòu)建DNA指紋和種子純度的鑒定、構(gòu)建分子標(biāo)記連鎖圖、基因定位和數(shù)量性狀的選擇、分子雜交育種等[9,10]。

　　曾明等[11]為探討葛屬植物間的親緣關(guān)系，利用RAPD技術(shù)對葛屬6種植物進(jìn)行分析，以確定它們之間的分類位置，聚類分析表明，葛麻姆P.montana(Lour.)Merr.和粉葛P.thomsoniiBenth不應(yīng)作為葛P.lobata(Willd.)Ohwi.的變種，應(yīng)獨(dú)立成種;峨眉葛P.omeiensisWangetTang不能作為一個獨(dú)立的種，應(yīng)歸屬于葛。唐俊[12]通過RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對13份葛屬植物進(jìn)行遺傳多樣性分析，從72個隨機(jī)引物中篩選出18個RAPD引物，共擴(kuò)增出171個標(biāo)記，多態(tài)性標(biāo)記達(dá)80%，聚類分析表明，當(dāng)遺傳距離為0.53時，可將13份葛種質(zhì)分為5類，且分類之間與地理分布上呈一定的相關(guān)性。

　　BettinaHeider等[13]通過RAPD標(biāo)記分析了5個葛P.lobata(Willd.)Ohwi.和16個三裂葉野葛P.phaseoloides種質(zhì)的種群間遺傳變異，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)變異是在種群之間或無性繁殖下的種質(zhì)之間發(fā)現(xiàn)的，而不是在內(nèi)部發(fā)生的;同時篩選出12個引物對葛進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出46個條帶，多態(tài)性標(biāo)記占54.3%;聚類表明，將5份材料聚為3類。聚類方式反映了采集的地理位置，并證實(shí)了在山谷內(nèi)的遺傳相似系數(shù)在0.71~0.87;并篩選出3個引物對16份三裂葉野葛進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出11個條帶，多態(tài)性條帶占45.55%，聚類分析表明，當(dāng)遺傳相似系數(shù)在0.31時，分為2個類群，它們進(jìn)一步分為6個亞類，三裂葉野葛的取樣地點(diǎn)的地理分布偏離了材料的聚類，與葛的研究結(jié)果形成了對比。

　　景戌等[14]利用RAPD分子標(biāo)記對12份重慶不同來源的葛根種植資源遺傳多樣性分析，并根據(jù)葛根素含量進(jìn)行聚類分析，12個RAPD引物共擴(kuò)增出109個條帶，多態(tài)性條帶占64.41%，葛根材料的遺傳距離在0.00~0.36之間，平均距離為0.19;RAPD分析的聚類分析表明，當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.2時，將12個葛根材料分為3類，依據(jù)葛根素含量進(jìn)行聚類分析表明，當(dāng)遺傳相似系數(shù)為2.5時，將12個葛根材料分為3類;兩者聚類分析都將12份葛根聚類為3類，但分類情況有所不同，應(yīng)將兩者結(jié)合并增大樣本量分析才能準(zhǔn)確的進(jìn)行劃分。

　　周精華等[15]人通過RAPD分子標(biāo)記對葛種質(zhì)資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，篩選出10個引物對8份葛材料進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出99個條帶，多態(tài)性比率為65.65%，遺傳相似系數(shù)0.626~0.939，聚類分析表明，當(dāng)遺傳系數(shù)為0.740時，將8份葛材料分為4類，且聚類分類與地理來源有關(guān)。紀(jì)寶玉等[16]利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)與葛根素的測定相結(jié)合的方法對11個不同產(chǎn)地的葛進(jìn)行遺傳多樣性分析，11個地區(qū)葛的葛根素為3.26%~7.10%，篩選出8個RAPD引物，共擴(kuò)增出45個條帶，多態(tài)性比率為82.22%;聚類分析表明11個不同產(chǎn)地葛被分為3大類，且聚類的親緣關(guān)系與地理分布距離相關(guān)，且與葛根素含量相結(jié)合的RAPD分析表明不同地區(qū)葛根藥材中葛根素含量與樣品間的遺傳相似性無顯著關(guān)系。

　　魏文愷[17]采用RAPD標(biāo)記對山西6個主要產(chǎn)地的葛資源進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，將6個不同產(chǎn)地的晉產(chǎn)葛分為3類。有研究表明，RAPD標(biāo)記的可靠性低于RFLP，SSR，AFLP3種分子標(biāo)記，并且RAPD為顯性標(biāo)記，在遺傳多樣性分析中很容易將非同源的擴(kuò)增片段誤認(rèn)為同一位點(diǎn)，因此而產(chǎn)生數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)錯誤[18]。RAPD反應(yīng)容易受到外界因素影響，重復(fù)性和穩(wěn)定性較差，限制了其進(jìn)一步的發(fā)展。

　　1.1.2SSR分子標(biāo)記

　　簡單重復(fù)序列(SSR)，也被稱為微衛(wèi)星DNA[19]，是由1~6個單核苷酸為重復(fù)單元串聯(lián)的重復(fù)序列。因其操作簡單方便、通用性強(qiáng)、分辨率高、重復(fù)性好且僅需少量DNA樣品，已被廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性分析、種質(zhì)鑒定、構(gòu)建遺傳連鎖圖譜、基因定位與克隆、數(shù)量性狀基因位點(diǎn)分析、構(gòu)建DNA指紋圖譜等研究。周榮榮等[20]人利用SSR分子標(biāo)記對江西不同種質(zhì)的粉葛進(jìn)行遺傳多樣性分析，用生物信息學(xué)的方法去尋找葛和甘葛藤基因組SSR序列，并尋找其差異基因，根據(jù)其差異基因設(shè)計(jì)了20對SSR引物，篩選出5對多態(tài)性強(qiáng)、擴(kuò)增帶型穩(wěn)定、重復(fù)性較好的引物對江西9個粉葛品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，共檢測到32個等位基因，16個多態(tài)性位點(diǎn)。

　　聚類分析表明，遺傳相似系數(shù)變異范圍為0.5433~1.000，平均遺傳相似系數(shù)為0.7359，將9個江西粉葛分為3大支，5對核心引物可將其準(zhǔn)確區(qū)分為6類粉葛種質(zhì)，說明可能存在“同物異名”或親緣關(guān)系非常接近的情況。微衛(wèi)星的分辨能力比以前可用的標(biāo)記更高，可以檢測源自特定親本的等位基因的種群行為[21]。但是SSR標(biāo)記的分析可能會帶來假陽性結(jié)果，導(dǎo)致DNA復(fù)制過程中聚合酶滑移、空等位基因或重疊的SSR，并且開發(fā)和合成引物投入高、難度大、相對費(fèi)時[22]。高昂的成本價格和開發(fā)的困難是制約SSR分子標(biāo)記發(fā)展的主要原因。

　　1.2DNA條形碼

　　DNA條形碼技術(shù)是分子鑒定的最新發(fā)展方向，它是利用一段短而標(biāo)準(zhǔn)的DNA序列作為標(biāo)記來實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確和自動化物種鑒定的方法。2003年由加拿大科學(xué)家Herbert提出DNA條形碼的概念[38]，2015年正式被收錄進(jìn)《中國藥典》并構(gòu)建中藥材DNA條形碼數(shù)據(jù)庫。適用于植物的條形碼主要包括psbA-trmH，rbcL，rpoC1，rpoB，matK，ITS，ITS2等。

　　DNA條形碼技術(shù)不受生長發(fā)育階段、生態(tài)環(huán)境及個體形態(tài)的限制，樣本用量少，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確、可重復(fù)性好且對操作人員要求不高，可以準(zhǔn)確地對中藥進(jìn)行分析鑒定。曾明等[39]人利用DNA條形碼技術(shù)對葛屬植物葛、粉葛和葛麻姆等進(jìn)行親緣關(guān)系分析，表明粉葛應(yīng)作為葛的變種，葛麻姆應(yīng)獨(dú)立成種，且ITS序列分析的結(jié)果與從化學(xué)成分分類的結(jié)果相吻合，但分析結(jié)果與使用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)分析的結(jié)果不同，RAPD標(biāo)記結(jié)果支持山葛和粉葛不應(yīng)作為葛的變種，應(yīng)獨(dú)立成種[11]。

　　RAPD分子標(biāo)記因其技術(shù)本身的局限性，導(dǎo)致結(jié)果不完全可靠，ITS序列分析結(jié)果更準(zhǔn)確，是鑒定葛屬植物的有效分子標(biāo)記技術(shù)。為了從基因?qū)用嫔蠟楦鸶�進(jìn)行選育優(yōu)良品種，余智奎[40]利用DNA條形碼技術(shù)對葛根種質(zhì)資源的基因型進(jìn)行研究并結(jié)合藥效成分進(jìn)行評價，結(jié)果表明，葛根ITS序列變異較大，基因型較多，共分為13個基因型;利用藥效成分含量進(jìn)行評價，發(fā)現(xiàn)基因型不同是導(dǎo)致葛根中葛根素含量差異的原因之一，但是不同基因型總黃酮含量無明顯變化;葉綠體基因trnL內(nèi)含子序列無變異，僅一個基因型，葉綠體基因psbK-psbI和trnH-psbA序列變異結(jié)果都將24個樣品分為2個基因型，且堿基位點(diǎn)變異與產(chǎn)地相關(guān)。每個物種DNA中G+C的含量是特定的，能夠反映屬種之間的親緣關(guān)系。

　　蔣向輝等[41]人基于ITS序列對11份葛屬種質(zhì)資源進(jìn)行親緣關(guān)系研究，結(jié)果表明，11份葛屬種質(zhì)的ITS序列G+C含量差異大，G+C含量在52.98%~59.89%之間，最大相差6.91個百分點(diǎn);遺傳距離為0.002~0.792;同時采用MP，NJ和UPGMA3種不同系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建方法進(jìn)行分析，均將11份種質(zhì)分為2大支，但各自分析結(jié)果有所不同，應(yīng)該綜合3種聚類方法獲得更可靠的結(jié)果。同時蔣向輝等[42]人通過形態(tài)學(xué)和rDNAITS序列方法對葛屬植物分類進(jìn)行一致性比較，兩種方法的分類結(jié)果雖有一定的相似性，但仍存在較大的差異。形態(tài)學(xué)特征容易受到生長條件、性狀選取等多方面因素影響，因此，基于ITS序列的分類結(jié)果更為可靠。

　　2葛根轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)研究進(jìn)展

　　轉(zhuǎn)錄組是后基因組時代最活躍的學(xué)科之一，轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)是研究葛根轉(zhuǎn)錄組學(xué)的重要手段，第2代高通量測序技術(shù)是當(dāng)前轉(zhuǎn)錄組測序中最主要的分析技術(shù)。

　　Han等[48]人利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，從葛根5種不同組織中獲得了9300萬個fastq格式讀數(shù)，隨后通過CLC從頭組裝方法，最終總共產(chǎn)生了83401個重疊群，有26245個重疊群產(chǎn)生了相應(yīng)的GO術(shù)語，獲得了對應(yīng)于16380個重疊群的1348個獨(dú)特的酶，并隨后使用KEGG檢索到了途徑;根據(jù)功能注釋結(jié)果，預(yù)測了45個重疊群，它們代表了大豆苷元生物合成的7個關(guān)鍵酶;通過檢索注釋數(shù)據(jù)，檢索到了41個表達(dá)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白;在數(shù)據(jù)集中有49個重疊群被標(biāo)注為葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶。

　　Wang等[49]人利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對葛進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，獲得了13.3G的有效數(shù)據(jù)，并從頭組裝出163625個單基因，其中70593個單基因(占組裝單基因的43.1%)在Nr蛋白數(shù)據(jù)庫中被成功注釋，有22684個單基因被歸類為25個KOG類別，有46467個單基因被分配給GO術(shù)語，有23949個單基因在KEGG數(shù)據(jù)庫中被注釋，并分配到308條不同的途徑;在葛轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)庫中，鑒定出54個異黃酮生物合成相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因序列，預(yù)測了117個單基因編碼PIUGTs，確定了51個編碼異黃酮O-甲基轉(zhuǎn)移酶的假定單基因，并且有327個單基因被鑒定為假定的MYB轉(zhuǎn)錄因子。

　　Nithiwat等[50]人利用高通量測序技術(shù)，對泰國葛根(Puerariacandolleivar.mirifica)的幼葉、成熟葉、塊莖皮層和去皮塊莖的聯(lián)合組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，總共產(chǎn)生了約8.2G的堿基對，重新組裝產(chǎn)生了166923個重疊群和104283個單基因;166923個重疊群，用于使用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能注釋，并作為識別可能參與異黃酮和葛雌激素生物合成的基因庫;在轉(zhuǎn)錄庫中，鑒定了21個可能參與異黃酮生物合成的基因，鑒定了85個可能編碼MYB轉(zhuǎn)錄因子的基因;經(jīng)qRT-PCR驗(yàn)證，這些單基因的DEG值在塊莖皮質(zhì)的表達(dá)水平高于其他三種組織。

　　3葛根功能基因的克隆及合成途徑研究

　　傳統(tǒng)中藥材的有效成分絕大多數(shù)是次生代謝產(chǎn)物，其合成途徑復(fù)雜，反應(yīng)過程往往需要十幾個甚至幾十個酶的催化，因此，找到形成特定產(chǎn)物的關(guān)鍵酶就成為對藥材進(jìn)行合成的分子機(jī)理與調(diào)控研究的關(guān)鍵步驟，從而進(jìn)一步利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)藥用植物的有效成分。葛根中含有異黃酮類、葛酚苷、香豆素類、三萜類、淀粉、多糖等成分[54]。葛根的藥用成分主要是異黃酮類化合物，其主要有效成分包括葛根素、大豆苷和大豆苷元等次生代謝物，具有保護(hù)心腦血管系統(tǒng)、降血糖和血脂、抗腫瘤、抗氧化、解酒等生物活性[55]，分別按照相應(yīng)生物合成途徑而產(chǎn)生。

　　4展望

　　分子生藥學(xué)是指在分子水平上研究生藥的分類與鑒定、栽培與保護(hù)及有效成分生產(chǎn)的一門科學(xué)[69]。分子生藥學(xué)是生藥學(xué)和分子生物學(xué)兩學(xué)學(xué)科交叉融合的產(chǎn)物，1995年由黃璐琦等[70]首次提出，分子生藥學(xué)的提出讓生藥的研究從宏觀表型性狀和微觀的顯微、化學(xué)成分等研究向基因水平邁進(jìn)，強(qiáng)化了對生藥細(xì)胞、組織、器官、有機(jī)體、種群等層次的重新認(rèn)識和思考。

　　隨著生物技術(shù)手段的飛快發(fā)展，分子生藥學(xué)已經(jīng)在生藥分子鑒定、藥用動植物的系統(tǒng)進(jìn)化和種質(zhì)資源評價及保存、藥用動植物瀕危機(jī)制及保護(hù)、藥用植物活性成分的生物合成及調(diào)控、藥用動植物的道地性及分子機(jī)理等方面已有了廣泛的應(yīng)用[71]。DNA分子鑒定技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等明顯優(yōu)勢，可作為葛屬植物的生藥鑒定手段，實(shí)現(xiàn)葛屬植物品種鑒定，區(qū)分葛根及其混偽品。

　　一些新型的分子標(biāo)記技術(shù)例如SCoT分子標(biāo)記技術(shù)、SRAP分子標(biāo)記技術(shù)和DNA條形碼技術(shù)等，對葛屬植物的分類、混偽品及亞種之間的鑒定結(jié)果更為準(zhǔn)確，但在葛屬植物中運(yùn)用較少，應(yīng)結(jié)合這些分子鑒定方法使鑒定更為準(zhǔn)確。利用分子生藥學(xué)技術(shù)對葛根有效成分的生物合成及相關(guān)基因的研究尚處于起步階段，雖然已有學(xué)者對部分葛根有效成分合成相關(guān)基因進(jìn)行了克隆和分析，但大部分調(diào)控代謝產(chǎn)物合成的基因還未有研究報(bào)道。

　　中藥論文投稿期刊：《中國現(xiàn)代中藥》原名《中藥研究與信息》，1999年3月創(chuàng)刊，是國家中醫(yī)藥管理局主管，中國中藥協(xié)會、中國醫(yī)藥集團(tuán)總公司、中國藥材公司主辦的國內(nèi)外公開發(fā)行的中藥行業(yè)綜合性科技期刊，月刊，2006年更名為《中國現(xiàn)代中藥》。

　　在今后的研究中，可充分利用多組學(xué)技術(shù)聯(lián)合分析，充分挖掘次生代謝產(chǎn)物生物合成的相關(guān)基因、基因酶、轉(zhuǎn)錄因子、調(diào)控蛋白以及次生代謝途徑等，建立次生代謝產(chǎn)物生物合成的相關(guān)模型，從而更好的理解葛根有效生物合成的相關(guān)分子機(jī)制。隨著后基因組時代的到來，對葛根基因組學(xué)大數(shù)據(jù)更容易獲得，從而從分子機(jī)制和基因組學(xué)的研究上解決葛屬植物在分類中的疑惑以及將野葛和粉葛臨床用藥實(shí)現(xiàn)本質(zhì)區(qū)分，葛根分子生藥學(xué)研究具有廣闊的發(fā)展前景。

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　　作者：楊碧穗1，黃秋連1，謝璐欣1，吳波1，鄧可眾1，吳志瑰1，朱衛(wèi)豐1，何紹浪2，黃琦3，朱玉野4，葛菲