摘要：玫瑰是一種重要的藥食兼用植物，栽培歷史悠久，被廣泛種植用于提取精油，具有較高的觀賞價值、經濟價值和藥用價值。玫瑰常規以扦插、分株、嫁接等方法繁殖，繁殖率較低，建立玫瑰組織培養體系可提高繁殖速度，有利于進行工廠化育苗。在玫瑰遺傳轉化方面，以農桿菌介導法應用最多，已獲得轉基因株系。本研究總結了前人在玫瑰組織培養中外植體選擇、外植體消毒、培養條件、初代培養、增殖培養、生根培養、煉苗移栽以及遺傳轉化等方面的研究成果，提出了目前研究中存在的問題，并對未來研究方向和產業應用前景進行了展望，以期為玫瑰組織培養研究、遺傳轉化體系建立以及工廠化育苗等工作的開展提供借鑒和幫助。

　　關鍵詞玫瑰;組織培養;遺傳轉化

　　玫瑰為薔薇科(Rosaceae)薔薇屬(Rosa)植物，是重要的藥食兼用植物，在生態涵養、景觀綠化、食品化工、醫藥保健等方面起著重要作用，以重瓣紅玫瑰(Rosarugosa„Plena‟)、大馬士革玫瑰(R.damascene)等為代表，其主要的商業用途為提取玫瑰精油(徐立軍等,2015,河北林業科技,(2):19-21)。中國是玫瑰種植大國，玫瑰資源豐富，品種繁多，山東平陰、北京妙峰山、甘肅苦水、新疆是國內主要的玫瑰種植地區。

　　農業栽培論文范例：玫瑰香葡萄汁冷凍濃縮響應面工藝優化與品質研究

　　目前，玫瑰產業品種退化等問題制約產業發展。同時，玫瑰存在著種間雜交親和力低、種子萌發弱以及種子幼苗成活困難等問題，其傳統繁殖方式(嫁接,扦插以及分株等)繁殖周期長且病蟲害嚴重，不利于工廠化種苗生產(霍書新等,2007)。植物組織培養是一種利用植物細胞全能性來進行快速繁殖的技術，應用組織培養技術快速繁殖優質種苗是一種行之有效的措施(李坤峰等,2014;陳宇杰等,2019,寧波大學學報(理工版),32(1):1-5)。此外，植物組織培養作為高效再生體系建立的重要環節，它通過控制再生體系的穩定性與再生頻率的高低，直接影響遺傳轉化效率(胡選萍等,2018)。

　　采用組織培養進行玫瑰種苗繁殖具有速度快、種苗脫毒等優勢，可以加速品種更新換代，促進玫瑰種植業更快更好地發展(尹利方等,2016,江西農業,(19):59)。目前，國內外學者對玫瑰組織培養進行了多方面的研究，在大馬士革玫瑰(R.damascene)、重瓣紅玫瑰(R.rugosa„Plena‟)等品種中均有報道，前人以莖段等為外植體，探究了腋芽萌發、增殖、生根培養的最佳培養基配方、煉苗移栽方法及培養條件，建立了組織培養技術體系，為生產應用提供了科學依據(李雪,2014;黃穎等,2014;陳宇杰等,2019,寧波大學學報(理工版),32(1):1-5)。

　　近年來，關于玫瑰遺傳轉化的研究報道較少，對玫瑰組織培養和遺傳轉化的研究進展也缺乏系統的的歸納和總結。本研究對玫瑰組織培養及遺傳轉化研究現狀進行了綜述，對目前存在的問題、未來研究方向及應用前景進行了探討，以期為玫瑰的快速繁育、遺傳轉化以及工廠化快速育苗等提供參考。

　　1玫瑰組織培養

　　1.1外植體選擇

　　外植體類型、取樣時期均會影響玫瑰離體組織培養體系的建立，組培苗的再生率、污染率也存在很大差異，選擇合適的外植體類型和采樣時間尤為關鍵(賈玉娟等,2018,林業科技通訊,(9):22-26)。已報道的玫瑰離體快繁的外植體主要包括玫瑰(R.rugosa)的莖段(Xingetal.,2010)、大馬士革玫瑰(R.damascene)的莖尖、莖段以及葉片(趙蓓蓓等,2011,園藝學報,38(S):2630;黃穎等,2014)、野生玫瑰(R.rugosa)的莖段(楊麗娟等,2010)、苦水玫瑰(R.sertata×R.rugosa)的莖段(張武等,2018)、重瓣紅玫瑰(R.rugosa„Plena‟)的莖段(楊博,2003,中國農業大學,pp.25-26)、墨紅玫瑰(R.chinensis„CrimsonGlory‟)的莖段(靳松等,2015)、紫枝玫瑰(R.rugosa„ZiZhi‟)的莖段(朱翠英等,2005)、以及滇紅食用玫瑰(R.rugosa„Dianhong‟)的莖尖和莖段(李曉亮等,2015)等。玫瑰不同類型的外植體組織培養效果差異較大，可能與玫瑰的品種、植物激素等相關。

　　同一品種的不同莖段取材部位也會影響到玫瑰組織培養的成功率，其中，當年生枝條上部和中部的帶芽莖段、莖尖褐變率低，是適于組織培養的理想材料(賈玉娟等,2018,林業科技通訊,(9):22-26)。玫瑰外植體取樣時間需兼顧外植體的再生能力和組培污染率等兩方面，宜在玫瑰再生能力強、攜帶病菌少的季節進行。對于莖段的組織培養，在芽休眠末期或者萌動初期效果最佳。已有研究對比新疆7月、9月以及11月不同時間采集的接種材料萌發率，發現11月采集的枝條腋芽萌發率最高，達到了84.2%(黃穎等,2014)。

　　由于不同地域氣候的差異，各地適合玫瑰外植體取樣時間也存在差異。在陜西地區，玫瑰莖段外植體的最佳選取時間在3~5月及10月中旬，而盛夏季節最不適于玫瑰組培(于�？坪蛷垙V軍,2002,陜西農業科學,(11):47-48)。在山東地區，4~12月份，外植體污染率逐漸上升，其中，4~9月份以細菌性污染為主，10~12月份枝條逐漸進入休眠，霉菌污染率逐漸升高，4月份是取樣的最佳時期(盧緒娟,2007)。

　　1.2外植體消毒

　　對于木本植物而言，組織培養最具挑戰的是無菌體系的建立(胡選萍等,2018)。消毒方式(消毒劑種類,濃度和消毒時間)的選擇對于植物組織培養的成敗起著至關重要的作用(汪騰越等,2012)。外植體消毒包括消毒劑浸泡處理、無菌水清洗等步驟，其中，75%乙醇(C2H5OH)、升汞(HgCl2)、次氯酸鈉(NaClO)等是玫瑰外植體的主要消毒劑。在消毒效果方面，升汞的效果最佳，次氯酸鈉次之。盡管升汞的消毒效果顯著，但它對人體存在極大的毒性，近年來被嚴格管控使用，而次氯酸鈉毒性低于升汞，高效廣譜，被廣泛使用。另外，在消毒劑處理前，對外植體表面進行清洗，也可降低污染率(邢文等,2014)。

　　玫瑰莖段消毒后宜切除兩端接觸消毒劑的部位，再進行組織培養，可減少攜帶的病菌，提高組織培養的成功率。外植體消毒時間尤為關鍵，不同玫瑰品種對消毒滅菌所能承受的時間存在差異。消毒時間過短，易出現消毒殺菌不徹底等問題，而時間過長會導致外植體的褐化死亡(賈玉娟等,2018,林業科技通訊,(9):22-26)。在玫瑰莖段消毒中，0.1%~0.2%升汞的消毒時間宜在5~8min，2%次氯酸鈉的消毒時間在20min左右，消毒效果最佳(孟長軍,2012,中國園藝文摘,28(8):177-178)。

　　以葉片進行體細胞胚組織培養時，葉片為莖段組培苗的無菌葉，不需要外植體消毒(Xingetal.,2014a)。以種子合子胚為外植體時，需對玫瑰種子進行70%乙醇消毒1min、1%次氯酸鈉溶液消毒15min等處理，以獲得無菌外植體(Kimetal.,2009)。除了消毒劑的選擇、消毒時間的控制，對外植體低溫預處理也有助于消毒充分，降低污染率。將玫瑰枝去葉剝刺后置于冰箱低溫處理7d，再進行消毒，發現該方法可有效降低污染，減輕褐變，也不影響莖段腋芽的萌發(于�？坪蛷垙V軍,2002,陜西農業科學,(11):47-48)。相關研究證實，在升汞或次氯酸鈉消毒過程中添加表面活性劑吐溫20(Tween-20)，可顯著提高消毒效果(楊博,2003,中國農業大學,pp.25-26)。

　　1.3培養條件

　　溫度、光照、濕度及pH值等是組織培養體系成功建立的重要環境因素。玫瑰的初代培養以MS為基本培養基，增殖培養主要以MS、WPM為基本培養基，生根培養主要以1/2MS為基本培養基(徐立軍等,2015,河北林業科技,(2):19-21)。基本培養基通常添加20~30g/L蔗糖、6~12g/L瓊脂，pH為5.8~6.2(楊博,2003;盧緒娟,2007)。溫度是組織培養的關鍵環境因子，生根階段對溫度的變化非常敏感，過高過低的溫度會導致嫩莖生根數量減少(姚曉惠等,2002,農業與技術,(5):25-28)。

　　在培養室溫度(25±2)℃、濕度30%~45%、光照時間12h/d條件下，玫瑰組織培養效果較好(李曉亮等,2017)。適宜的光照強度是玫瑰組培苗正常生長的必要條件，2000~3000lx的光照強度為最佳光強范圍(盧緒娟,2007)。黑暗培養對葉片不定芽的誘導起到重要作用，研究發現，最適合玫瑰不定芽誘導的暗培養時間為10~15d，在暗培養結束后，外植體繼續在誘導培養基上轉入光照培養，15~20d后再轉入增殖培養基，培養效果最好(邢文等,2014)。

　　1.4初代培養

　　初代培養是植物組織培養過程中必不可少的一個環節，又稱為啟動培養。選擇合適的培養基和植物生長調節劑，能促進莖段腋芽的萌發，也能促進葉片快速、大量地產生不定芽，實現植物快速無性繁殖(陳宇杰等,2019,寧波大學學報(理工版),32(1):1-5;李雪等,2020)。在莖段腋芽萌發中，使用的植物生長調節劑包括細胞分裂素類的6-芐氨基嘌呤(6-BA)、玉米素(ZT)、噻苯隆(TDZ)、二氯苯氧乙酸(2,4-D)等，生長素類的α-萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)和赤霉素(GA3)等。6-BA與NAA兩種植物激素在玫瑰初代培養中最適濃度、比例的研究較為深入。

　　有研究以玫瑰幼嫩葉片為外植體，建立不定芽再生體系，發現6-BA是影響愈傷組織質量的主要因素(盧緒娟,2007);在玫瑰嫩莖基部直接再生芽苗的誘導研究中，也發現6-BA的濃度尤為關鍵，過高濃度的6-BA會抑制玫瑰芽苗再生(李敏等,2016,江蘇農業科學,44(6):81-83)。

　　6-BA最適濃度因品種而存在差異，如重瓣紅玫瑰為1.5mg/L(陳宇杰等,2019,寧波大學學報(理工版),32(1):1-5)，紫枝玫瑰為0.4mg/L(朱翠英等,2005)。在初代培養中，NAA濃度通常低于6-BA濃度，以0.02~0.3mg/L較適宜。黃穎等(2014)在MS培養基中添加不同濃度NAA，發現NAA濃度為0.1mg/L時，腋芽萌發率較高，可達到97.5%。植物激素TDZ是玫瑰葉片愈傷組織再生不定芽的必要條件(盧緒娟,2007)，當TDZ濃度為1.5mg/L誘導時，葉片不定芽誘導效果最佳(邢文等,2014)。

　　1.5增殖培養

　　在玫瑰的繼代増殖培養階段，不同生長調節劑配比是影響叢生芽繼代増殖的關鍵(Kimetal.,2009;李雪,2014;邢文等,2014)。增殖培養使用的生長調節劑主要是NAA、6-BA、GA3與2,4-D等，叢生芽的發生源主要為腋芽和不定芽。6-BA和NAA的濃度影響增殖效果，當6-BA濃度為0.5~3.0mg/L、NAA濃度為0.01~0.1mg/L時，增殖效果較佳。

　　在WPM培養基中，6-BA在0.6~1.5mg/L時，苦水玫瑰的叢生芽增殖倍數隨6-BA濃度的增加呈逐步上升趨勢，其中，6-BA濃度達到1.5mg/L時，叢生芽的增殖系數最高，為3.56(張武等,2018)。大馬士革玫瑰芽苗增殖系數隨6-BA和NAA濃度的提高而增加，其中WPM+6-BA3.0mg/L+NAA0.1mg/L為最佳的繼代增殖培養基(徐立軍等,2015,河北林業科技,(2):19-21)。

　　在MS培養基中，6-BA濃度為1.0mg/L時，大馬士革玫瑰新芽的增殖能力最強，增殖系數最大，為4.2(黃穎等,2014)。增殖效果最佳的6-BA濃度可能與玫瑰品種、培養基類型等因素相關。植物激素的選擇也影響到愈傷組織增殖、不定芽再生。

　　TDZ有利于誘導玫瑰愈傷組織再生不定芽，相比TDZ，6-BA不能誘導不定芽，但有利于不定芽增殖再生，2,4-D對不定芽的再生有顯著的抑制作用，MS+TDZ2.0mg/L+IBA0.1mg/L是玫瑰葉片愈傷組織再生不定芽的適宜培養基(盧緒娟,2007)。在不定芽增殖培養中，低濃度6-BA和NAA組合下增殖效果較佳(張娜等,2011)。

　　邢文等(2014)發現，葉片愈傷組織分化出的不定芽在MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L培養基上增殖培養，均能形成幼苗。不同的是，以合子胚為外植體進行增殖繼代培養時，使用的培養基為1/2MS+2,4-D2.26μmol/L培養基(Kimetal.,2009)。在基于體細胞胚再生體系建立的遺傳轉化中，發現抗生素濃度對體細胞增殖存在影響，抗生素濃度過高，體細胞增殖困難，甚至褐化死亡(邢文等,2014,中國園藝學會觀賞園藝專業委員會,pp.209-216)。

　　此外，培養基類型、植物激素種類和配比、葡萄糖濃度等也都會影響體細胞胚的增殖，體細胞胚在MS+2,4-D1.0mg/L+BA0.01mg/L+葡萄糖45g/L培養基上增殖效果最佳(Xingetal.,2014a)。Xing等(2014b)應用了這種培養基進行體細胞胚增殖培養，用于培育轉基因玫瑰。

　　1.6生根培養

　　相比初代培養和增殖培養兩個階段，玫瑰組織培養中的生根培養更為困難。近年來關于生根培養的研究主要圍繞植物生長調節劑種類及配比的篩選以及根褐化機理分析等方面開展，已取得了一定的進展。NAA、IBA、6-BA和2,4-D是誘導生根的主要植物生長調節劑，其配比在不同玫瑰品種生根培養中存在差異。

　　據報道，NAA和IBA與促進植物細胞分裂和根的分化相關，6-BA與細胞分裂、頂端優勢改變以及芽的分化等有關(李曉亮等,2015)。盡管IBA也具有促進生根的作用，研究發現，利用IBA誘導的根系普遍較為細弱，NAA比IBA更利于促進玫瑰生根(李雪,2014)。

　　NAA對大馬士革玫瑰不定芽生根率及生根數影響顯著，芽苗生根率隨NAA濃度提高而降低，平均生根數隨NAA濃度的提高而增加(徐立軍等,2015,河北林業科技,(2):19-21)。這與黃穎等(2014)的研究報道一致，當NAA濃度增大時，其生根率卻降低，表明生根培養時NAA濃度不宜過高。ABA激素和IAA、IBA或NAA等多種激素同時使用不能促進大馬士革玫瑰生根，而單獨添加2,4-D激素可有效誘導生根，在MS+2,4-D2.5mg/L生根培養基上培養2周后，轉入無植物激素的MS培養基繼續培養，根系生長效果較好(JabbarzadehandKhosh-Khui,2005)。

　　1.7煉苗移栽

　　煉苗移栽是玫瑰組培苗由無菌的培養基環境向露地栽培轉變的重要環節。玫瑰組培苗與大田苗在形態和組織上存在差異，如組培苗無根毛，葉片角質層不發達且移栽初期保水能力差等(盧緒娟,2007)。煉苗馴化可促進玫瑰組培苗適應外界環境。研究發現，煉苗的方法和時間直接影響試管苗的移栽成活率(趙鑫等,2007)。

　　煉苗方法總結為：將培養幼苗的組培瓶在組培室內揭蓋，培養2~3d，再將組培瓶轉移到栽培環境培養3d左右，可實現玫瑰組培苗的煉苗馴化。煉苗后的組培苗移栽時需要清洗根部的培養基，對移栽基質消毒殺菌，移栽期間需注意保持溫度和濕度。移栽方法總結為：用5mg/L高錳酸鉀溶液洗去組培苗根部的培養基，再轉移到100倍多菌靈消毒過的腐爛松針、泥炭土和細河砂(1:2:1)混合的移栽基質中，薄膜覆蓋以保濕保溫，濕度保持在70%~80%，溫度控制在(20±2)℃，每天自然光照9h，3d后通風換氣，7d后揭膜，每天適時噴灑清水2次，成活率可達95%以上(楊麗娟等,2010)。

　　2玫瑰遺傳轉化

　　遺傳工程技術對改良現存玫瑰品種顯示了極大的潛力，通過導入外源基因，改善抗病性、花香、花期、精油品質等性狀。體細胞胚胎發生是細胞工程中植株再生的重要途徑之一(賈彩鳳等,2004)。以葉片等材料誘導出初生體細胞胚，誘導的體細胞胚經增殖培養可形成次生體細胞胚，次生體細胞胚發生過程可為遺傳轉化提供穩定的胚性材料(Raemakersetal.,1995)。

　　農桿菌介導法是遺傳轉化的主要方法，利用體細胞發生過程進行遺傳轉化已在部分薔薇屬植物中應用(Lietal.,2002)。如在月季(Rosahybrida)的遺傳轉化中，胚狀體培養技術已被成功應用(王伏林和胡張華,2003,亞熱帶植物科學,32(1):65-67)。早在1994年，國外學者利用花絲誘導的體細胞胚與農桿菌共培養，獲得了首例轉基因月季(Firoozababyetal.,1994)。隨后，轉花青素相關基因CHS、抗菌蛋白相關基因等的月季也相繼被報道(Souqetal.,1996;Dohmetal.,2001)。大部分月季品種以體細胞胚為受體材料進行遺傳轉化，而玫瑰是以體細胞胚的增殖、萌發再生為基礎，以次生體細胞胚為受體材料，利用次生體細胞胚發生體系進行遺傳轉化(邢文等,2014,中國園藝學會觀賞園藝專業委員會,pp.209-216)。

　　3展望

　　玫瑰組織培養是遺傳轉化體系建立的關鍵，實現玫瑰的遺傳轉化可定向培育轉基因玫瑰(Xingetal.,2014b;Shenetal.,2019)。此外，將組織培養與輻射誘變結合，建立復合育種技術，也具有應用價值。如對月季莖段進行γ射線輻射誘變后繼續進行組織培養，獲得了花色突變的月季新品種(BalaandSingh,2013)。這種復合育種技術在玫瑰的遺傳改良中還未被報道，具有極大的研究潛力和應用價值。

　　病毒誘導的基因沉默(virus-inducedgenesilencing,VIGS)技術是一種RNA水平轉錄后的基因沉默現象，能夠快速鑒定基因功能，目前已在月季中應用，用于鑒定基因功能(任浩然等,2019)。研究發現，VIGS試驗中，組培苗相比扦插實生苗能夠更高效、快速呈現沉默效果，在進行侵染操作時還具有體積小，較便捷、易操作的優勢，可以作為株型、成花誘導等相關基因功能研究的理想材料(丁榕等,2018)。

　　然而，VIGS技術還未被應用于在玫瑰基因功能研究。將VIGS技術與組織培養技術相結合，可為玫瑰基因功能研究提供新思路。近年來，玫瑰產業發展迅速，已成為中國鄉村振興下的特色優勢產業。隨著玫瑰種植業規模和體系不斷擴大，人們對新品種、優質種苗快速繁育方法的需求持續增加。玫瑰組織培養和遺傳轉化的研究可為工廠化脫毒種苗生產、遺傳轉化、新品種培育等提供重要的技術支撐，具有極大的發展空間。

　　目前，玫瑰的組織培養和遺傳轉化還存在的主要問題包括：

　　(1)組培苗邊葉黃化、玻璃化、褐化現象較嚴重;(2)生根困難以及煉苗移栽難以成活;(3)體細胞胚培養體系待優化;(4)遺傳轉化效率低，轉化細胞再生植株再生困難;(5)組織培養和遺傳轉化在實際生產中應用不足。在今后的研究中，建議從以下幾方面進行深入研究：(1)對不同玫瑰品種的組培快繁體系歸納總結、優化與改進，建立高效的再生體系，應用于種苗生產繁育中;(2)加強體細胞胚培養技術研究，結合遺傳轉化、誘變育種等方法培育玫瑰新品種，豐富玫瑰種質資源;(3)目前農桿菌介導法是玫瑰遺傳轉化的主要方法，基因槍轉化法等轉化方法在玫瑰中的研究還較少，未來可探究多樣的遺傳轉化方法，建立高效轉化、再生的遺傳轉化體系;(4)進一步擴大玫瑰組織培養和遺傳轉化的應用研究，實現工廠化脫毒種苗生產、轉基因玫瑰新品種培育。

　　參考文獻

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　　作者：程浩*歐陽琳*苗保河**