摘 要：【目的】為了解決百合在北方鹽堿地區(qū)百合種球生長(zhǎng)和產(chǎn)量的問(wèn)題�！痉椒ā恳� OT型百合 ‘Robina’為 材料，克隆了百合液泡膜鈉氫逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 (LoNHX2)，并使用前期試驗(yàn)得出的半致死濃度200mM NaCl 對(duì)百合種球進(jìn)行處理，通過(guò)熒光定量分析百合LoNHX2基因在鹽處理后不同時(shí)間及不同部位的表達(dá)狀況。 【結(jié) 果】結(jié)果表明：(1)百合LoNHX2基因全長(zhǎng)為1608bp，編碼525個(gè)氨基酸; (2)百合 LoNHX2蛋白性質(zhì)穩(wěn) 定，由20種氨基酸組成，為脂溶性蛋白;(3)200mM NaCl對(duì)百合種球根系進(jìn)行鹽脅迫處理后，LoNHX2基 因在百合根部的表達(dá)量隨時(shí)間變化，呈先上升再下降趨勢(shì);(4)對(duì)百合盛花期不同部位中LoNHX2基因表達(dá)量 分析，LoNHX2基因在花瓣中表達(dá)量最高，其次是葉片、莖、根，表達(dá)量最低的是鱗莖。 【結(jié)論】發(fā)現(xiàn)百合 LoNHX2基因在鹽脅迫中有重要作用，可通過(guò)降低細(xì)胞質(zhì)中 Na+ 的濃度，從而降低高鹽脅迫對(duì)植物細(xì)胞的傷 害。為百合種球耐鹽分子育種提供理論依據(jù)，對(duì)百合在北方產(chǎn)業(yè)化發(fā)展及園林應(yīng)用方面具有重要意義。

　　關(guān)鍵詞：百合;鹽脅迫;LoNHX2;基因克隆

　　百合多數(shù)品種喜微酸性土壤，但北方地區(qū)的土 壤偏堿，對(duì)百合根系造成持續(xù)鹽堿脅迫，嚴(yán)重影響 種球生長(zhǎng)和產(chǎn)量。目前對(duì)百合鹽脅迫的研究主要 集中在生理生化特性研究，有報(bào)道0.8%～0.9%的 NaCl可能是百合所承受的最大鹽脅迫濃度[1];劉艷 妮等在1%鹽濃度脅迫下對(duì)亞洲百合進(jìn)行抗鹽性突 變體篩選，得到抗鹽性誘變百合植株[2-3];左志銳等 比較2個(gè)百合的葉綠體和線粒體的超微結(jié)構(gòu)，研究 了品種'Sorbonne'和'Prato'在 低 鹽 處 理 下 的 結(jié) 構(gòu) 變化[4]。

　　轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)攝取、代謝產(chǎn)物釋放以及 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等廣泛的細(xì)胞活動(dòng)中起著重要的作用[5]。 已有研究表明植物體內(nèi)存在多個(gè)與 Na+ 轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān) 的蛋白，如液泡膜上的 Na+/H+ 逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(vac- uolarNa+/H+ antiporter/exchanger，NHX)和 細(xì) 胞質(zhì) 膜 上 的 Na+/H+ 逆 向 轉(zhuǎn) 運(yùn) 蛋 白 (SaltOverly Sensitive，SOS)[5]。液 泡 膜 NHX 蛋 白 主 要 行 使 Na+ 在液泡中區(qū)域化的功能，在提高植物耐鹽性方 面發(fā)揮了重要作 用[6]。

　　He等 將 擬 南 芥 AtNHX1 轉(zhuǎn)入棉花后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因棉花能在高濃度 NaCl條 件下正常生長(zhǎng)[7]。目前，NHX2基因研究較多，已 在擬 南 芥[8]、羽 衣 甘 藍(lán)[9]、番 茄[10]、小 麥[11]、大 葉 藻[12]等多種植物中克隆出來(lái)，并做了進(jìn)一步研究。 另外，NHX 基因在轉(zhuǎn)基因植物擬南芥、番茄、茄果 和水稻中也證實(shí)了耐鹽性的改善[8]，但 NHX 基因 在百合中尚少有相關(guān)研究。

　　百合為鹽敏感植物，土壤鹽堿化現(xiàn)象一直是困 擾百合種植生產(chǎn)的重要問(wèn)題，研究百合鹽脅迫機(jī)理 及其耐鹽適應(yīng)性，在理論和應(yīng)用方面都具有重要意 義。就此以 OT 型(東方百合與喇叭百合系間雜種) 百合‘Robina’為材料，用200mM NaCl對(duì)百合種球 進(jìn)行處理，分析百合 LoNHX2基因在不同時(shí)間及 不同部位的表達(dá)狀況，為研究百合鹽脅迫下的基因 表達(dá)調(diào)控機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

　　1 材料與方法

　　1.1 植物材料

　　采用 OT 型百合品種‘Robina’為材料，取若干 種球種于北京農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地溫室內(nèi)，生長(zhǎng)期間進(jìn) 行常規(guī)管理，待生長(zhǎng)30d后，用200mM NaCl溶液 對(duì)種植30d的百合進(jìn)行處理，分別取處理后的0、6 h、12h、24h的百合根系，同時(shí)，取常規(guī)培養(yǎng)的盛花 期百合的根、莖、葉、花瓣、鱗莖，以上材料包上錫箔 紙快速放入液氮中備用。

　　1.2 百合 RNA的提取及cDNA的合成 使用 植 物 RNA 快 速 提 取 試 劑 盒 (EASYspin Plus，艾德萊)提取根系樣品的總 RNA，用反轉(zhuǎn)錄試 劑盒(TaKaRa)合成cDNA，最后用紫外核酸蛋白測(cè) 定儀調(diào)節(jié)cDNA 模板濃度至基本一致。采用1.2% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性。

　　1.3 百合LoNHX2基因的克隆 根據(jù)課題組前期已有的百合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果 中的非重復(fù)序列基因unigene，查找 LoNHX2基因， 對(duì) LoNHX2基因的 unigene進(jìn)行序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)5′ 端較 完 整，3′端 有 缺 失。 參 照 3-′RACE 試 劑 盒 (TaKaRa)操作步驟分別進(jìn)行 3′RACE 擴(kuò)增，設(shè)計(jì) 3′RACE 特 異 性 引 物 3′GSP (GAAAAGTG- GAGATTTGTCAGCA)和 3′ NGSP (AATC- CCTATTTTCGTCGCTCAT)，并測(cè)序，通過(guò)DNA- MAN 軟件拼 接，獲 得 LoNHX2 基 因 全 長(zhǎng) cDNA。 再根據(jù)最大開(kāi)放閱讀框設(shè)計(jì)上游引物 LoNHX2-F (ATGGGTATCGATTTGGAGCCGG)和下游引物 LoNHX2-R(TCATTCCCATTCAGGGACGCTT )，以 cDNA 為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖 凝膠電泳，用 DNA 回收試劑盒(TaKaRa)進(jìn)行切膠 回收，用pMD19-TVector連接轉(zhuǎn)化并測(cè)序。

　　2 結(jié)果與分析

　　2.1 百合根系總 RNA提取質(zhì)量分析

　　對(duì)提取的百合根系總 RNA 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電 泳，電泳條帶完整，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

　　2.2 百合LoNHX2基因3’RACE克隆 在課題組前期進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中已有 的 LoNHX2 unigene 序 列 的 基 礎(chǔ) 上，經(jīng) 過(guò) 3’- RACE 后，將 目 的 條 帶 進(jìn) 行 切 膠 回 收、pMD19-T Vector連接轉(zhuǎn)化及菌液測(cè)序，得到1條501bp條帶 。

　　3 結(jié)論與討論

　　本 研 究 根 據(jù) 轉(zhuǎn) 錄 組 測(cè) 序 中 已 知 的 百 合 LoNHX2基因片段序列，設(shè)計(jì)3’端引物，通過(guò)巢式 PCR擴(kuò)增，克隆得到大小為 501bp的 3’端序列。 將克隆 得 到 的 3’端 序 列 與 已 知 序 列 拼 接，得 到 LoNHX2基因全長(zhǎng)cDNA 序列，在最大開(kāi)放閱讀 框 ORF外設(shè)計(jì)全長(zhǎng)特異性引物，經(jīng)過(guò) PCR 擴(kuò)增得 到大小為1608bp的全長(zhǎng)序列，其中包括起始密碼 子 ATG 和 終 止 密 碼 子 TGA，共 編 碼 525 個(gè) 氨 基 酸。

　　用 DNAMAN 軟件將其翻譯為蛋白序列后發(fā) 現(xiàn)，百合 LoNHX2 蛋白的分子式為 C2751H4267N677 O736S28，相對(duì)分子量為59498.92，理論等電點(diǎn)(PI) 為7.27，該蛋白為脂溶性蛋白、穩(wěn)定蛋白。LoNHX2 蛋白由20種氨基酸組成，蛋白由內(nèi)向外有11個(gè)跨 膜螺旋，由外向內(nèi)有12個(gè)跨膜螺旋，無(wú)信號(hào)肽。二 級(jí)結(jié)構(gòu)中，α-螺旋(Alphahelix)和延伸鏈(Extended strand)所占比例最多。LoNHX2蛋白序列與擬南 芥、水 稻、玉 米 相 似 度 分 別 為 90.51%、89.42%、 90.69%。在獐毛中，用400mM NaCl處理6h后，根部 AINHX1基因的的表達(dá)量相對(duì)于莖部明顯升高， 說(shuō)明根部對(duì)鹽脅迫更敏感。

　　在處理6h和12h時(shí)， 根部AINHX1基因的的表達(dá)量比對(duì)照 CK 分別上 升了6倍和8倍，處理24h后表達(dá)量降低[13]。本試 驗(yàn)結(jié)果與這一致。本試驗(yàn)中，在200mM NaCl處理 后，LoNHX2基因在百合根部的表達(dá)量呈先上升 再下降趨勢(shì)。

　　園藝論文投稿刊物：《園藝學(xué)報(bào)》是中國(guó)園藝學(xué)會(huì)主辦的學(xué)術(shù)性期刊，刊登果樹(shù)、蔬菜、西瓜甜瓜和觀賞植物等方面示曾發(fā)表過(guò)的學(xué)術(shù)論文、研究報(bào)告、研究簡(jiǎn)報(bào)、專題文獻(xiàn)、綜述，經(jīng)過(guò)審定或鑒定的新品種、新書(shū)介紹、學(xué)術(shù)活動(dòng)信息等。

　　在處理0、3、6、12h時(shí)表達(dá)量逐漸升 高，處理24h時(shí)表達(dá)量降低。此外，在大麥[14]、水 稻[15]、灰綠狼尾草[16]中有相似的表達(dá)狀況。說(shuō)明 LoNHX2基因在植物鹽脅迫中有重要作用，可降低 細(xì)胞質(zhì)中 Na+ 的濃度，從而降低高鹽脅迫對(duì)植物細(xì) 胞的傷害。 在百合不同部位 中，LoNHX2 基 因 在 花 瓣 中 表達(dá)量最高，其次是葉片、莖、根，表達(dá)量最低的是 鱗莖，說(shuō)明LoNHX2基因的表達(dá)具有普遍性，在不 同部位表達(dá)差異量較大。這可能與在百合盛花期 時(shí)采集樣 品 有 關(guān)，盛 花 期 時(shí) 花 瓣 中 各 細(xì) 胞 較 為 活 躍、代謝旺盛，所以 LoNHX2表達(dá)量較高，與此同 時(shí)葉片、莖等組織部位均已處于成熟期，所以表達(dá) 量較低。本研究克隆了百合 LoNHX2基因序列， 并分析了百合LoNHX2基因在不同時(shí)間及不同部位的表達(dá)狀況，發(fā)現(xiàn)了LoNHX2基因的表達(dá)規(guī)律， 為研究百合鹽脅迫下的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理提供了 理論參考。

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　　作者：王安琪，薛曉霞，左 楊，張克中，崔金騰