摘要：【目的】為石斛屬的植物生殖生物學研究提供基礎數據�！痉椒ā坷�用半薄切片顯微觀察石斛屬模式植物金釵石斛雌配子體和胚發育過程。【結果】在授粉前，胎座未發育;授粉后30d，位于胚珠原基末端的細胞體積增大變為孢原細胞;授粉后40d，孢原細胞變為細胞核明顯的大孢子母細胞;授粉后60d左右，大孢子母細胞體積不再繼續擴增，開始進行減數分裂;從授粉到雌配子體成熟大約需要70d的時間;授粉后80d合子進行第一次分裂，分裂為兩個細胞，包括一個基細胞和一個頂細胞;授粉后110d，多次分裂后頂細胞形成早期球形胚;授粉后120d，胚細胞已填滿囊腔，胚柄開始液泡化;授粉后150d，球形胚結構穩定，胚柄已消失;授粉后180d，胚成熟�！窘Y論】金釵石斛為側膜三胎座，倒生型胚珠，薄珠心，單孢子蓼型胚囊。授粉前，胚珠原基未發育，授粉后180d，胚才能完全成熟，即形成成熟的種子。

　　關鍵詞：金釵石斛;雌配子體;胚發育

　　石斛蘭(Dendrobium)是蘭科石斛屬植物的總稱，為蘭科(Orchidaceae)的第二大屬[1]。石斛屬植物有著極高的觀賞價值，與卡特蘭(Cattleya)、蝴蝶蘭(Phalaenopsis)、文心蘭(Oncidium)同為世界上四大觀賞洋蘭[2]。隨著人們對觀賞石斛消費需求的擴大，觀賞石斛的育種已成為越來越關注的熱點[3]。

　　有研究表明石斛屬內有很多種有自交不親和現象，部分種也有異交不親和現象[4]，所以研究石斛屬植物胚發育是解決雜交敗育及進行胚搶救育種的第一步。蘭科植物中授粉后花粉管的長出會刺激大孢子的發育和雌配子體的形成，持續50～90d。從授粉到果實成熟需要6～8個月。授粉后6周左右，大花杓蘭(Cypripediummacranthum)的種胚發育為球形胚[5]。無距蝦脊蘭(Calanthetsoongiana)授粉后60d，合子形成完成受精，合子第一次橫向分裂為基細胞和頂細胞，頂細胞發生縱裂，之后經過數次胚細胞的分裂形成成熟的胚胎[6]。

　　扇脈杓蘭(Cyp-ripediumjaponicum)授粉前，子房的胎座有稍許分化，在胎座形成一些突起。在授粉10d后，胎座分化出隆起的胚珠原基，胚原基頂端的孢原細胞，分化為具有明顯細胞核的大孢子母細胞，之后胚原基基部的細胞突起形成內珠被，然后外珠被開始發育。授粉后35d，發育成熟的雌配子體準備好受精。受精后經95d胚胎發育成熟，其胚胎發育過程和無距蝦脊蘭類似，也為石竹型[7]。本研究旨在通過對金釵石斛(Den.nobile)大孢子發生、雌配子體發育以及胚發育等進行研究，為石斛屬植物生殖生物學研究提供相關資料，為研究石斛屬雜交育種敗育現象奠定基礎。

　　1材料與方法

　　試驗材料為中國林科院科研溫室內的金釵石斛。于2017年2、3月份對金釵石斛開花植株進行人工授粉、標記。金釵石斛授粉后每隔10d取1次果莢，每次3個，以授粉前子房為對照，將樣品切塊放在2%多聚甲醛和2.5%戊二醛的混合溶液中，經1%的鋨酸室溫固定，然后將樣品依次經過50%、70%、80%、90%、100%的丙酮溶液脫水。

　　逐步完成丙酮和Spurr樹脂的置換和浸透，樣品放入新配制的Spurr樹脂中靜置1h后放入60℃烘箱中24h完成包埋與聚合，將包埋好的樣品用超薄切片機切片，切片厚度3μm，在切片上滴加數滴濃度為0.5%的甲苯胺藍溶液，染色3～4min后，用蒸餾水沖洗干凈，在光學顯微鏡下觀察然后拍照。

　　2結果與分析

　　2.1大孢子發生和雌配子體發育

　　金釵石斛的子房為側膜胎座三心皮，在授粉前，胎座未發育。授粉后，胎座之間空隙變大，胎座上細胞開始迅速增殖分裂，在內膜脊上形成指狀突起，授粉后10d每個胎座上分化出一些小枝。授粉后20d，每個胎座上的小枝又繼續分化，指狀突起數量變多。隨著胎座小枝上細胞持續分裂，子房不斷膨大。授粉后30d，指狀突起分化為成千上萬個胚珠原基，由一列細胞外加一層表皮細胞組成，位于胚珠原基末端的細胞體積增大變為孢原細胞。授粉后40d，相對于其他細胞，體積明顯增大，孢原細胞變為細胞核明顯的大孢子母細胞。

　　隨著大孢子母細胞的體積不斷增大，胚珠原基開始彎曲，最后整個胚珠體發生180度的轉換，珠柄與珠孔靠近，形成倒生型胚珠。孢原細胞發育為大孢子母細胞之后，胚珠原基基部的表皮層細胞向外突起生長形成衣領狀結構，為內珠被。隨后，外珠被也開始發生，由內珠被靠近底部的細胞分化而來。在受精前，內珠被不斷向上生長，包住大孢子母細胞，在雌配子體成熟前后內珠被生長完成，包住珠心，形成珠孔。隨著內珠被的不斷生長，大孢子母細胞也不斷伸長。

　　授粉后60d左右，大孢子母細胞體積不再繼續擴增，準備進行減數分裂。大孢子母細胞減數第一次分裂是橫向的，產生2個不對稱的細胞，靠近珠孔方向的細胞較小很快便壓縮退化，合點方向的功能性二分體細胞較大，接下來發生橫軸方向上的減數第二次分裂，形成具有4孢子的直列式四分體，4個孢子中只有1個參加雌配子體的發育，其余3個在四分體形成的過程中先后退化。參加雌配子形成的大孢子進行有絲分裂，第一次分裂形成初生珠孔核和初生合點核;第二次分裂珠孔方向產生一對核，合點方向產生一對核;第三次分裂珠孔方向和合點方向各形成4個核，這種由單孢子分裂形成的八核胚囊稱為蓼型胚囊。從授粉到雌配子體成熟大約需要70d的時間，但即使是同一子房其雌配子體發育的時間也不完全一致。

　　2.2受精后胚的發育

　　配子結合形成受精卵后，細胞質呈均勻狀態。授粉后80d合子進行第一次分裂，分裂為兩個細胞，包括1個基細胞和1個頂細胞，頂細胞在合點方向，細胞體積小，基細胞靠近珠孔方向，液泡很大，基細胞之后會分化為胚柄，胚柄起固定胚體的作用，其他組織細胞的養分可以通過胚柄運輸至胚。授粉后90d，金釵石斛的頂細胞發生橫軸方向上的分裂，基部的細胞不分裂，形成一 列三細胞原始胚，依此判斷金釵石斛的胚發生類型為石竹型。但偶有切片觀察發現頂細胞首次分裂為縱軸方向上的分裂。

　　一列三細胞原胚接下來的分裂也分為兩種情況：原胚頂端細胞發生縱軸方向上的分裂形成4細胞T型胚體;兩個頂細胞同時在縱軸方向上分裂。繼續分裂形成6細胞、8細胞原胚，同時胚柄體積增大。在胚發育的整個過程，內珠被沒有發育，和外珠被細胞相比，內側的珠被細胞較小，由一層緊密排列的細胞組成，受精之后并逐漸退化濃縮成為一層緊密包裹胚體的超薄細胞。授粉后110d，多次分裂后頂細胞形成早期球形胚。授粉后120d，胚細胞繼續分裂，數量變多，囊腔被填充滿，此時胚柄細胞已開始裂解。授粉后150d，早期原胚發育為球形胚，胚柄只留下痕跡，基本完全消失。之后，胚體積穩定，有絲分裂停止，胚細胞細胞質非常濃厚。

　　3結論與討論

　　一般有花植物的胚珠是伴隨著花的發育過程逐漸成熟的，但蘭科植物胚珠發育具有獨特的模式，即在授粉前胚珠沒有發育或僅有部分不完全發育，只有在授粉后才能啟動進一步的發育。金釵石斛雌配子發育的特點與樹蘭(Epidendrumiba-guense)[5]、卡特蘭(Cattleya)[7]、無距蝦脊蘭(Calanthetsoongiana)[7]和舌唇蘭(Platantherasusannaeil)[8]相同。

　　在授粉前胚珠并沒有開始發育，只有在授粉后才開始發育;杓蘭類(Cypripedi-um)[9.10]、玉鳳蘭(Habenriagrandifloriformis)[8]、火燒蘭屬(Epipactis)[11]授粉前胚珠已經開始發育，只是不能分裂形成大孢子細胞，授粉后大孢子才能進一步發育。在植物進化史上，蘭科植物被認為是進化程度最高的，這可能是在長期的自然選擇中進化出最節省能量的方式—只有授粉后胚珠才能真正開始發育。對不同植物而言，從花粉落到母本柱頭到受精的時間差別很大，短則幾分鐘，長則幾天數月，蘭科植物相對于其他植物從授粉到受精間隔時間較長，本研究發現，金釵石斛授粉后70d完成受精。

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　　金釵石斛授粉前胎座未發育，授粉后胎座上有隆起發生，子房有少許膨大。說明授粉后產生了某種刺激而促使胎座發育，這種刺激有可能是人工授粉導致的，也有可能是花粉管生長過程中對子房的刺激從而產生了某些激素或某些物質，這些激素能夠調節其他營養器官的養分運輸到子房，從而促進胚珠的發育。蝴蝶蘭授粉后刺激體內產生了乙烯從而促進了胎座的發育[12]，金釵石斛的胎座發育是由上述哪種情況引起，刺激體內產生了何種物質還有待研究。

　　參考文獻：

　　[1]BillL，WayneH.DendrobiumandItsRelatives[M].U.S.A：TimberPress，2002：8-35.

　　[2]王雁，李振堅，彭紅明.石斛蘭資源生產應用[M].北京：中國林業出版社，2007：11.

　　[3]王雁，周進昌，鄭寶強，等.石斛蘭[M].北京：中國林業出版社，2015：225-281.

　　[4]黃捷.石斛屬植物交配親和性研究[D].廣州：華南農業大學，2016.

　　[5]LituievDS，GrossniklausU.Patterningoftheangiospermfe-malegametophytethroughtheprismoftheoreticalparadigms[J].BiochemicalSocietyTransactions，2014，42(2)：332-339.

　　[6]連靜靜，錢鑫，王彩霞，等.無距蝦脊蘭胚珠發育及種子形成研究[J].西北植物學報，2013，33(3)：494-500.

　　[7]鄭寶強，王雁，郭欣.卡特蘭雌配子的發育[J].林業科學研究，2015，28(4)：497-501.

　　[8]SwamyKK，KumarHNK，RamaswamySN.ContributionstothemegasporogenesisandmegagametogenesisinHabenriagrandifloriformisLindl.andPlatantherasusannaeilLindl.(Orchidaceae)[J].AdvancesinPlantSciences，2005，18(2)：439.

　　作者：張艷慧1，鄭寶強1，繆崑1，侯芳梅2*，王雁1*