摘要：SNP基因分型芯片是分子育種的重要工具，高密度SNP芯片往往存在標記冗余、價格高、目標性不強等問題，是分子育種走向常規化、規模化的主要限制因素之一。在此，我們開發了一款低密度育種芯片，并就芯片在種質資源評價中的價值進行了分析。首先，我們對份玉米自交系進行0X重測序，獲得了8.2Mb的SNP標記，從中挑選2,080個NP;再從已開發55K芯片中挑選3,390個缺失率低、多態性高、ConversionType為PolyHighResolution的標記;最后從apMap3中挑選586個標記，設計的育種芯片共包含6,056個SNP，采用靶向測序基因型檢測(Genotypingbytargetsequencing,GBTS)技術對標記進行檢測。通過自然群體、雙親群體和多親本重組自交系(Multiparentadvancedgenerationintercross,MAGIC)群體驗證表明，設計的育種芯片平均捕獲率為0.6，檢測到的原始設計位點數為4,773～5,963個，AF>0.4和IC0.4的標記比例分別為57.6和88.6。用該芯片對26份玉米種質資源進行評價，主成分分析可以將其劃分為溫帶和熱帶兩大類群，PGMA聚類分析進一步將其劃分為個已知類群，分別是瑞德、蘭卡斯特、旅大紅骨、四平頭和熱帶類群，Structure群體結構分析沒有出現最佳值，但熱帶材料都獨立成群;類群內和類群間的遺傳距離平均值分別為0.394和0.47，其中群內的遺傳距離最小(0.316)，熱帶類群內的遺傳距離最大(.424);類群間，瑞德與熱帶之間的遺傳距離最大(0.493);類群間的遺傳分化系數(ST)表明，類群與其他類群間的ST均較大。

　　關鍵詞：玉米;NP;育種芯片;種質資源

　　分子育種技術的大規模推廣應用依賴于分子標記成本的降低[1]。相比其他遺傳標記，單核苷酸多態性(Singlenucleotidepolymorphisms,SNP)標記在基因組中含量豐富、穩定性強、鑒定效率高3]。在玉米基因組中，每44～75bp就會出現一個SNP[35]。

　　此外，SNP一般為二等位基因標記，易于估計群體中等位基因頻率。隨著分子生物學的發展，不同通量的SNP基因分型平臺得到了廣泛的應用，對于少數NP，主要的技術平臺是競爭性等位基因特異性PCR(KompetitiveallelespecificPCR,KASP)和Taqman技術，而高密度SNP標記的鑒定主要通過全基因組重測序、簡化基因組測序(Genotypingbysequencing,GBS)、固相芯片和靶向測序基因型檢測(Genotypingbytargetsequencing,GBTS)(液相芯片)。

　　全基因組重測序或者簡化基因組測序可以獲得大量的NP，適合用于群體遺傳研究，但需要配備相應的服務器并建立生物信息學分析平臺。固相芯片的理論基礎是雜交測序，具有特定的物理載體，目前的兩種主要平臺是AffymetrixAxiom和IlluminaInfinium，分別使用顯微光蝕刻和微珠技術。

　　利用固相芯片已經在水稻[6]、小麥[78]、大豆[9]等作物上開發了一系列芯片。液相芯片因具有靈活性、廣適性、高效性等特點，在動植物中已經開發了余套標記集10]。目前，玉米中已經開發了多款芯片[1113]，在種質資源鑒定和分子標記輔助選擇(Markerassistedselection,MAS)中發揮了一定的作用。

　　然而，高密度的芯片在育種中往往存在標記冗余、價格高、目標性不強等問題，是分子育種走向常規化、規模化的主要限制因素之一，開發低密度的育種芯片，不但可以降低成本，還可以提高檢測效率。因此，我們根據遺傳多樣性豐富的份玉米自交系的基因組重測序數據，并結合5K芯片中的優良NP標記，開發了一款高質量、高性價比，適合在育種中應用的低密度育種芯片，并利用該育種芯片對國內外常見的玉米自交系進行了評價。

　　1材料與方法

　　1.1實驗材料

　　實驗材料共包括兩部分，第一部分材料包含份自交系，進行0X重測序，用于芯片的標記開發，材料名稱見附表;第二部分材料，包含個自然群體、個雙單倍體(DoubledHaploid,DH)群體和個多親本重組自交系(Multiparentdvancedgenerationintercross,MAGIC)群體，用于芯片的驗證。其中自然群體包含了226份玉米自交系，國內常用自交系46份，包括常用自交系73、鐵922、丹98等，國外引進自交系份，其中份ML自交系來自于國際小麥玉米改良中心(TheInternationalMaizeandWheatImprovementCenter,IMMYT)，其他為ML衍生系。

　　DH群體包含了171份自交系，親本分別為B73和CXS161，其中XS161是掖78與旱的回交改良系，系譜為(掖78×旱);MAGIC群體是16份親本(其中份熱帶材料，分別為ML290、ML411、ML426、ML43、ML496、R0401、R0505和TMA238，份溫帶材料，分別為Mo17、Lx9801、旱、吉19、鐵922、81565、鄭和昌)通過兩兩雜交，再經過自交產生的，目前已經自交了代，共包含297份自交系，編號分別為～M297，加上親本共13份。群體的親本73和X161在不同批次中進行了兩次生物學重復。

　　1.2芯片設計與開發

　　芯片原始設計6,056個SNP標記，SNP標記共有三個來源：(1)對37份玉米自交系進行0X重測序，共獲得963.4的CleanReads,與B73RefGen_v4參考基因組比對后檢測到8.2的NP，過濾后的NP數為.8，根據最小等位基因頻率(Minorallelefrequency,MAF)和標記的分布挑選了高質量的NP共2,080個;(2)根據已有盤共,072個樣品的55K芯片數據，從中挑選缺失率(Missingrate)5.0%、AF0.35、ConversionType為PolyHighResolution的標記，考慮性狀相關標記和標記在染色體上的均勻分布，共挑選了3,390個標記，其中包含與抗穗腐病、耐漬和耐低磷相關的標記93個[1416];(3)最后從apMap3中挑選586個標記，用于填補前兩個步驟中標記間隔比較大的區間。

　　標記的檢測采用GBTS技術，在中玉金標記生物(北京)技術股份有限公司進行檢測。BTS主要包括以下五個步驟[1]：(1)利用超聲波將基因組DNA進行片段化并加上測序接頭;(2)將帶有生物素標記的RNA探針與已經帶有接頭序列的DNA片段結合;(3)鏈霉親和素包裹的磁珠與上一步的雙鏈復合物相結合(探針過量);(4)清洗得到目標區域的DNA，目的是去除非特異性雜交，提高捕獲效率;(5)對洗脫下來的DNA產物進行PCR擴增，構建Illumina測序文庫; 測序數據下機后使用ATK的模型進行變異檢測，用vcftools進行標記過濾。

　　2結果與分析

　　2.1標記統計分析

　　將226個玉米自交系構成的自然群體和71個系的靶向測序數據分別比對到玉米B73RefGen_v4參考基因組上，使用ATK進行變異檢測。自交系群體比對獲得NP標記58,135個，過濾后剩余83343個，以個體Q10miss0.2maf0.05過濾后獲得NP標記5,589個，其中2,217個NPs在設計目標位點上或者上下游00bp內;以個體Q20miss0.1maf0.05過濾獲得521個NPs，標記均在目標位點或上下游50bp內，其中原始設計位點4,773個，從NP在基因組中的分布情況看，外顯子中NP分布最多，其次為基因上游;每個目標區段平均檢測到.1個NP。DH群體使用相同的軟件及參數進行分析，在個體符合Q10miss0.2的過濾條件下，上述4,521個SNP在家系中有2,192個被檢測到，比例為0.5。

　　對AGIC群體及親本的13份份材料目標區域測序后進行比對，ATK檢測獲得NP標記99,154個，過濾后剩余45646個，以GQ10miss0.2maf0.05過濾后獲得586個NPs，其中5,967個NPs是最初設計的原始標記，以GQ10miss0.1maf0.05過濾后獲得50130個NPs，其中5,767個NPs是最初設計的原始位點。其中，自然群體和DH群體檢測的NP與AGIC群體檢測的NP相比，共同檢測到的原始設計位點數為,560個。兩個材料73和XS161生物學重復的一致性均為9.2，不考慮缺失基因型時一致性均為9.9。

　　2.2類群劃分

　　主成分分析結果顯示，當C=2時，自然群體可以明顯地劃分為兩個類群，分別是熱帶類群和溫帶類群，熱帶類群不同自交系的前兩個主成分比較聚集，而溫帶類群則比較分散。PGMA聚類分析可以將226個自交系分為個類群，依據骨干自交系，這個類群分別是熱帶、瑞德、蘭卡斯特、四平頭和旅大紅骨。熱帶材料共有份，包括份ML自交系以及ML衍生的自交系，一些含有熱帶血緣的自交系如N165也被劃分為熱帶類群;瑞德類群包含了份自交系，骨干自交系73、84、黃及先玉335的母本系H6WC都被劃分為瑞德類群。

　　本次類群劃分與之前我們用5K芯片和0K系列芯片劃分的類群略有不同[112]，區別是將、Iodent類群統一為瑞德，如鐵922、遼053、遼114等傳統上屬于群，由于群與瑞德的關系較近，本次我們將其歸為瑞德類群;蘭卡斯特、四平頭和旅大紅骨則分別包含了 和份自交系，與之前的劃分結果一致[112]，總體上，對226份種質資源的評價結果與已知的我國玉米材料類群劃分是一致的[1920]。用tructure軟件將值設置為～10，與Lu等[19]的研究結果一樣，沒有出現最佳值。

　　3討論

　　利用育種芯片進行選擇，一般能夠縮短世代間隔，提高選擇的準確度，加快遺傳進展。我國育種芯片研究始于997～1998年，盡管起步晚，但是發展很快，在玉米、水稻、小麥、大豆等主要農作物上開發了不同密度的育種芯片或者微陣列。由于玉米基因組大、結構復雜、重組率高、材料類型豐富，開發高質量、高密度SNP陣列的存在很多障礙[21]。

　　目前，玉米中開發的芯片包括基于Affymetrix平臺的00K芯片[11]、5K芯片[12]和～0K芯片[13]，基于Illumina平臺的0K芯片[22]和芯片[23]，基于GoldenGate平臺的36微陣列[24]和3072微陣列[25]，基于GenoBaits的0K系列液相芯片[1]等。這些芯片的開發為玉米遺傳研究提供了重要的支撐。傳統的固相芯片的理論基礎是NA雙螺旋的互補配對。雖然固相芯片鑒定的準確度比較高，但存在的問題是價格高、鑒定周期受樣品量的限制。以我們開發的5K芯片為例，定制規格為384×55K，個樣本的生物學重復一致率在7.1～98.9，缺失率平均值為.83[12]，雖然略低于目前開發的低密度育種芯片，但相比其他芯片已經具有較高的質量。

　　然而，在實際應用的時候，往往需要幾個科研機構或者育種公司湊足84個樣本才能上機，基因型鑒定的周期從天延長到平均兩個月甚至更長，大大限制了其在分子標記輔助選擇中的應用。我們開發的0K系列液相芯片解決了5K芯片的上述限制[1]，0K系列液相芯片適合用于種質資源鑒定、遺傳圖譜構建和全基因組選擇等。利用0K系列液相芯片進行種質資源鑒定和類群劃分時，我們發現0K與10K、標記的劃分結果完全一致，說明玉米育種中類群的劃分使用更低密度的芯片即可，而降低密度可以進一步降低成本。

　　例如，當標記密度降低到原來的一半時，成本降低為原來的三分之二，而當標記密度降低為原來的四分之一時，成本約為原來的一半[1]，因此，有必要開發精準高效的低密度育種芯片。我們利用新開發的低密度育種芯片對國內外常用的自交系進行群體結構和雜種優勢群的劃分，當C=2時，首先將26份自交系劃分為溫帶與熱帶兩個類群，其中來自于IMMYT的自交系大多屬于熱帶材料，部分含有熱帶血緣的材料如N165和WM(中糯父)也被劃分為熱帶類群，這與前人的研究結果和育種實際相一致[1226]。

　　玉米種植論文： 常見的玉米病蟲害及其防治技術分析

　　進一步利用PGMA聚類分析將26份自交系劃分為個類群，除熱帶類群外，溫帶類群包括瑞德、蘭卡斯特、四平頭和旅大紅骨個亞群，這與我國玉米主要類群相一致[2731]，與應用高密度芯片相比，低密度育種芯片能夠簡化類群劃分，如應用55K芯片將S602劃分為Iodent類群，將53、J005和A156等劃分為類群[1215]，此次統一劃分為瑞德類群。因此，新開發的低密度育種芯片能夠在降低成本的同時優化玉米類群劃分。

　　參考文獻

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　　作者：郭子鋒，王山葒，劉蓓，李文學，王紅武