摘要：【背景】植物促生菌劑產品在農業生產上的應用越來越廣泛，但人們對促生菌在基質栽培條件下對作物根系微生物群落影響的了解有限。【目的】明確在基質栽培條件下，促生菌假單胞菌(Pseudomonassp.)JP2-3和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Z54對番茄生長和根系細菌群落的影響。【方法】通過蘸根和灌根處理，分別將2株促生菌接種到基質栽培的番茄上。通過對番茄苗期各生長指標調查，明確促生菌對番茄生長的影響。利用16SrRNA基因擴增子測序技術，分析接種促生菌對番茄根系細菌群落組成和結構的影響。【結果】兩種促生菌均能促進番茄生長：JP2-3處理組的4種生長指標(株高、莖粗、最大葉長、最大葉寬)均比對照組大;除莖粗外，Z54處理組其余3種指標均大于對照組。接種JP2-3和Z54改變了番茄根系細菌群落的α多樣性，豐富度指數和多樣性指數都比對照組低，而且Z54處理組降低更為顯著(<0.05)。接種菌株Z54使根系細菌群落的β多樣性發生了明顯變化，而菌株JP2-3對β多樣性影響相對較小。番茄根系細菌群落的主要優勢菌門有：變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteriodetes);主要優勢菌屬有：鏈霉菌屬(Streptomyces)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、艾德昂菌屬(Ideonella)、德沃斯氏菌屬(Devosia)等。在門水平上，基質栽培的番茄根系細菌群落組成與土壤栽培相似，但在屬水平上有較大差異。接種JP2-3提高了艾德昂菌屬(Ideonella)、游動放線菌屬(Actinoplanes)和水居菌屬(Aquincola)等菌屬的相對豐度;接種Z54則提高了短波單胞菌屬(Brevundimonas)和黃桿菌屬(Flavobacterium)等菌屬的相對豐度。在上述相對豐度增加的菌屬中，有多種細菌是植物益生菌。基于線性判別效應量分析(LEfSe)的結果表明，JP2-3處理組的生物標志物主要集中分布于β-變形菌綱(Betaproteobacteria)和放線菌綱(Actinobacteria)，而Z54處理組主要集中于γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)。【結論】在基質栽培條件下，施用假單胞菌(Pseudomonassp.)JP2-3和枯草芽孢桿菌(.subtilis)Z54，對番茄根系細菌群落組成和結構產生了不同的影響。兩種菌分別提高了不同土著有益微生物的相對豐度，在促生菌和土著有益微生物的協同作用下促進了番茄的生長。

　　關鍵詞：促生菌;高通量測序;基質栽培;微生物群落

　　番茄(Solanumlycopersicum)含有豐富的番茄紅素、維生素、礦物質等營養物質，深受人們喜愛，是世界上種植范圍最廣、總產量最高的蔬菜作物之一。隨著設施農業的逐漸發展，番茄在我國的栽培面積不斷擴大，已成為種植面積排名第四的蔬菜品種[1]。由于常年重茬連作以及化肥農藥的不合理使用，導致土傳病害發生嚴重、土壤質量不斷下降，制約了設施農業的可持續發展。

　　植物栽培論文：醬用番茄落花落果原因及預防脫落措施

　　然而無土栽培是解決上述連作障礙問題的有效途徑[2]，其中，基質栽培因其具有技術要求低、前期投資少、病蟲害少、節水節肥、栽種靈活、可控性較高等優點，在實際生產中應用最廣泛[3]。目前常用的栽培基質由草炭、菌渣、秸稈、稻殼、蛭石、爐渣、珍珠巖等有機和無機原料混配而成[4]，具有透氣、保濕、輕質等優點。

　　正常生長的植物根系富集了各種各樣的微生物，其中有大量的植物促生菌(PlantGrowthPromotingRhizobacteria,PGPR)，這類微生物一般通過生物固氮或溶磷作用為植物提供氮素及磷素營養物質[5]，另外還有一些PGPR可以分泌抗生素、植物激素等代謝產物以及產生鐵載體等物質，促進植物根系吸收礦物質和水分，進而促進植物的生長發育，抑制病原微生物生長，減少植物病害的發生[6-7]。常見促生菌有芽孢桿菌屬(Bacillusspp.)、假單胞菌(Pseudomonasspp.)、放線菌(Actinomycesspp.)、根瘤菌(Rhizobiumspp.)和木霉菌(Trichodermaspp.)等[8-9]。其中有多種微生物已開發成商品化菌劑，隨著人們對化肥農藥濫用危害的關注以及對健康和環境問題的重視，植物促生菌劑產品在農業生產上的應用越來越廣泛，具有廣闊的應用前景。

　　健康植物的根系微生物通過競爭和協作形成了比較穩定的群落結構，這些微生物對于植物的生長發育、抗病、抗逆至關重要[10]。以往的研究往往關注對基質養分的優化，對基質中的微生物群落了解較少。近年來，隨著微生物組測序、高通量培養、人工重組體系等方法的建立及應用，極大地提高了人們對根系微生物群落結構和功能的認知能力和水平，已發現土壤理化性質、植物基因型、根系構型等因素對根系微生物群落具有較大影響[10-11]。

　　栽培基質的組成與土壤有較大的不同，與土壤相比，基質的緩沖能力非常低。關于添加促生菌對基質栽培作物根系微生物群落產生的影響目前人們了解較少。本研究通過在番茄的基質栽培過程中接種促生菌，檢測菌株對番茄生長的影響，并利用擴增子高通量測序技術分析接種促生菌對番茄根系細菌群落組成和結構的影響，以期為促生菌在番茄基質栽培中的應用提供理論依據。

　　1材料與方法

　　1.1材料

　　1.1.1番茄品種魯青嬌粉，由山東魯青種苗有限公司提供。

　　1.1.2促生菌枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Z54和假單胞菌(Pseudomonassp.)JP2-3，本實驗室保存。其中，枯草芽孢桿菌Z54對多種植物病原菌具有生防效果，而且能促進植物生長[12];假單胞菌JP2-3具有較強的溶磷能力，可以促進作物生長[13]。

　　1.1.3栽培基質栽培基質由山東商道生物科技股份有限公司提供，主要原料為稻殼、牛糞、作物秸稈等，按1:1:2比例摻混腐熟而成。

　　1.2番茄的栽培溫室試驗在濟南市魯青生態蔬菜體驗中心(117.1039°E，36.5841°N)進行。栽培方式采用槽式栽培，栽培槽采用挖溝槽鋪塑料膜的方式。栽培槽的形狀為梯形，上口寬60cm，底寬40cm，深度20cm。槽面覆蓋0.01mm的塑料膜，然后填加栽培基質至稍高出栽培槽口。

　　1.3促生菌接種液的制備劃線接種B.subtilisZ54和Pseudomonassp.JP2-3到LB平板上，置于培養箱中30°C培養48h，然后分別挑取單菌落接種于營養肉湯培養基中，30°C、180r/min條件下培養72h。取細菌培養液于8000r/min離心10min，棄上清，加無菌水洗滌菌體沉淀2次，重懸菌體，調整菌液濃度為1×108CFU/mL。

　　1.4接種方式

　　分2次進行接種，第1次在番茄移栽前進行蘸根處理，將待定植的番茄苗根部置于濃度為1×108CFU/mL菌液中浸泡5min，然后進行移栽。第2次在定植后第7天進行灌根處理，在每株番茄根部澆灌20mL濃度為1×108CFU/mL菌液。以清水作為對照，每個處理設置3個小區重復，每個小區面積為1.5m×12m，各處理的小區在溫室內隨機分布。

　　1.5番茄生長指標的調查

　　在定植后的第14天，調查菌株對番茄生長的影響，采取隨機取樣調查，每個處理調查10株番茄，調查的指標包括株高、莖粗、最大葉長和最大葉寬。

　　1.6根系樣品的采集

　　在定植后的第30天，進行番茄根系樣品的采集。樣品采集方法參考胡雅麗等[14-15]的方法，每種處理隨機取6株番茄，取樣時用鐵鍬向下挖取約15cm，取出其中番茄的根，抖落根上攜帶的基質，將番茄的根全部剪下，粗剪成段，混勻，抓取一部分裝入50mL的離心管中。每個離心管加入35mL的磷酸鹽緩沖液，在轉速為180r/min的搖床上振蕩清洗20min，將根轉入新的50mL離心管，再重復上述清洗步驟2次。

　　1.7樣品DNA提取及高通量測序

　　采用植物DNA提取經典方法(CTAB法)，提取番茄根系樣本的總DNA。提取結束后，進行瓊脂糖凝膠電泳，使用NanoDrop2000檢測DNA濃度。用無菌水將獲得的適量DNA稀釋至1ng/μL，以此作為PCR擴增模板，對細菌16SrRNA基因的V5−V7可變區進行PCR擴增。PCR擴增使用的是Phusion®High-FidelityPCRMasterMix試劑盒，擴增體系參照試劑盒的使用說明，擴增引物為799F(AACMGGATTAGATACCCKG)和1193R(ACGTCATCCCCACCTTCC)。

　　PCR反應條件：98℃1min;98℃10s，50℃30s，72℃30s，30個循環;72℃5min。PCR產物經瓊脂糖凝膠回收后，使用TruSeq®DNAPCR-FreeSamplePreparationKit建庫試劑盒進行文庫構建，構建好的文庫經過Qubit和QPCR定量，文庫合格后，使用NovaSeq6000進行上機測序，每個樣本測序數據量為50000tags以上。高通量測序工作在北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

　　1.8數據處理及生物信息學分析

　　下機數據處理與分析參照Liu[16]的方法進行。利用Vsearch合并雙端測序數據，根據Barcode序列和PCR擴增引物序列從合并的序列中截去Barcode和引物序列，并進行序列質控和去冗余[17]。然后使用Usearch對有效序列進行非聚類法去噪，獲得擴增序列變體(AmpliconSequenceVariants,ASVs)[18]，基于RibosomalDatabaseProject數據庫(RDP)去除嵌合體和進行物種注釋[19]。使用Usearch計算α多樣性指數、稀釋曲線、β多樣性等，使用R語言(version4.1.0)對樣品物種組成及相對豐度統計結果繪制箱線圖、韋恩圖(Venn)、主坐標分析圖(PrincipalCo-ordinatesAnalysis,PCoA)和堆疊柱狀圖等。通過LEfSe分析獲得不同處理的生物標志物，其中篩選標準設置為LDAscore>2。

　　2結果與分析

　　2.1促生菌對番茄生長的影響

　　在番茄定植14天后，通過對番茄生長指標的調查，判斷菌株對番茄生長的影響。接種促生菌的2個處理組番茄植株的株高、最大葉長、最大葉寬指標均比對照組CK要大。對于上述3個指標，菌株Z54處理的促生效果都比菌株JP2-3明顯。然而對于番茄莖粗的影響，接種菌株Z54的處理比對照CK略小，菌株JP2-3處理比對照CK大。根據統計分析，接種促生菌顯著增加了番茄最大葉長(P<0.05)，而對另外3個生長指標的影響不顯著。造成差異不顯著的原因是，苗期生長受種子的影響較大，番茄植株個體之間差異較大，各生長指標數值比較離散。總體來說，接種枯草芽孢桿菌(B.subtilis)Z54和假單胞菌(Pseudomonassp.)JP2-3都能促進番茄的生長發育。

　　2.2番茄根系微生物物種組成情況

　　基于RDP數據庫，對3組處理18個樣品的擴增子序列進行分析和物種注釋，共獲得1978個細菌ASVs，鑒定出細菌17門32綱64目140科301屬。在門水平上，番茄根系細菌群落的優勢菌門有變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteriodetes)，這4個門的相對豐度占總體的90%以上，其中變形菌門(Proteobacteria)的相對豐度最高。該結果與其他研究報道的土壤栽培番茄根系細菌群落組成相似，說明盡管基質與土壤的理化性質存在較大差異，但番茄根系細菌群落在門水平上的組成比較相似。

　　通過對3組樣本的稀釋曲線(圖3)進行分析，發現從樣本中隨機抽取一定測序量的數據，Richness數目先快速上升而后趨于平緩，說明隨著測序量的增大，初期檢出大量物種，后期樣本群落的物種豐富度變化趨緩，低豐度物種逐漸被檢出，物種豐富度上升速率降低，說明測序量已基本達到飽和，能比較完整地反映細菌群落的結構和種類。從稀釋曲線上可以看出，各組樣品的豐富度大小順序為CK>JP2-3>Z54，說明接種促生菌降低了番茄根系細菌群落的豐富度，其中Z54的影響最大，推測其原因是Z54對其他細菌具有較強的抑制作用。

　　對3組處理樣本中相對豐度≥0.05%的細菌ASVs進行統計和比較。CK、JP2-3和Z54組的ASVs數目分別為275、263和244，其中3組共有ASVs數目為114，各自特有的ASVs分別為55、52和111，分別占各組總ASVs數的20%、19.8%和45.5%。Z54處理組特有ASVs數最多，說明Z54組較另外2組有更多的特有微生物種類。三組之間兩兩比較，JP2-3組與CK組共有的ASVs數目最大，為206個，高于Z54與JP2-3組(119)或Z54與CK組共有ASVs數(128)，說明與Z54組相比，JP2-3組與CK組的微生物種類具有更好的相似性。上述結果表明，接種JP2-3和Z54都引起了番茄根系細菌組成的變化，其中Z54的影響更大。

　　2.3不同處理的番茄根系微生物群落的α多樣性

　　α多樣性是指特定群落或生境內的物種多樣性，常用指標為ACE、Chao1、Richness、Shannon指數等，前3個指標反映物種豐富度，Shannon指數同時表征豐富度和均勻度，反映了細菌群落多樣性。接種促生菌后，對番茄根系細菌群落的α多樣性指數影響如圖5所示，各組ACE、Chao1和Richness指數大小順序為：CK>JP2-3>Z54。其中CK組和JP2-3組組間差異不顯著(P>0.05)，而與Z54組組間差異顯著(P<0.05)，即接種促生菌JP2-3降低了細菌群落豐富度，但差異不明顯，而接種促生菌Z54顯著降低了細菌群落的豐富度。

　　JP2-3組和Z54組的Shannon指數低于CK組，說明添加促生菌降低了番茄根系細菌群落多樣性和均勻度，而且Z54處理組與CK組差異顯著(P<0.05)。上述結果表明，接種JP2-3和Z54降低了番茄根系細菌群落的豐富度和均勻度，其中Z54的影響比較顯著。這可能是由于枯草芽孢桿菌Z54能產生抗生物質，抑制了其他細菌的生長，從而顯著降低了細菌群落的豐富度和均勻度;而假單胞菌JP2-3對其他細菌的抑制作用較弱，因此影響不顯著。

　　3討論與結論

　　本研究利用16SrRNA基因擴增子高通量測序技術分析了基質栽培的番茄在分別接種促生菌枯草芽孢桿菌(B.subtilis)Z54和假單胞菌(Pseudomonassp.)JP2-3后的根系細菌群落組成和結構，通過比較不同處理之間的細菌群落結構，解析了在基質栽培條件下接種2種促生菌引起的番茄根系細菌種群變化差異。通過文獻檢索，我們未發現相同的研究報道。

　　因此，本研究結果對于了解促生菌在基質栽培條件下引起的作物根系細菌群落變化提供了重要信息，為指導促生菌在番茄基質栽培中的應用提供了理論依據。本研究發現，在基質栽培條件下，番茄根系細菌優勢物種主要有變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteriodetes)等，其中變形菌門的相對豐度占比最大。

　　該結果與其他研究報道的土壤栽培番茄根系細菌群落組成相似。例如：Lee等[20]收集了韓國7個地區23個溫室土壤種植的番茄樣品，檢測發現這些番茄根系細菌群落的優勢菌門為變形菌門、放線菌門、擬桿菌門和厚壁菌門;Cheng等[21]對11個番茄品種的根系細菌群落進行研究，發現變形菌門、擬桿菌門和酸桿菌門等占優勢。通過與上述結果比較，我們還發現在土壤栽培條件下，其他菌門的相對豐度比基質栽培條件下高，說明土壤栽培條件下番茄根系細菌群落的多樣性更高。

　　在屬水平上，Lee等[20]發現番茄的19個核心OTU隸屬于12個菌屬，其中僅有鏈霉菌屬(Streptomyces)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、根瘤菌屬(Rhizobium)3個屬在本研究的優勢菌屬中發現，表明基質栽培和土壤栽培的番茄根系細菌種群在屬水平的組成上存在較大差異。Cheng等[21]的研究中也比較了一個番茄品種在5種土壤和2種基質中的根系細菌群落，發現在不同土壤中番茄根系細菌種群在組成和結構上相對比較保守，但與基質中有顯著的不同。

　　接種促生菌假單胞菌JP2-3后降低了番茄根系細菌群落的豐富度和多樣性，但與CK組相比差異不顯著(P>0.05)。劉輝等[22]的研究發現了相似的結果，單獨接種溶磷細菌熒光假單胞菌JW-JS1可以提高NL-895楊根系土壤微生物群落的物種均勻性，但降低了微生物種群的多樣性。

　　在門水平上，接種JP2-3的處理組中細菌群落的優勢物種種類未變化，但放線菌門的相對豐度略有上升。這與羅路云等[23]的研究結果一致，噴灑沼澤紅假單胞菌菌劑PSB06可以改善土壤微生物區系，提高土壤中放線菌所占的相對豐度，而放線菌是土壤中的主要類群，可以抑制土壤病害、促進土壤養分循環。在屬水平上，接種JP2-3后，增加的優勢菌屬主要有艾德昂菌屬(Ideonella)、游動放線菌屬(Actinoplanes)和水居菌屬(Aquincola)。Ideonellasp.TH17[24]被報道可以有效去除NH4+-N，將其轉化為生物質氮。

　　Actinoplanes[25]則被報道具有產生吲哚乙酸、鐵載體及磷酸鹽增溶活性，還對水稻病原菌有拮抗能力，能夠顯著促進水稻幼苗生長。可見，接種假單胞菌(Pseudomonassp.)JP2-3在一定程度上能夠提高植株中有益微生物的相對豐度。接種枯草芽孢桿菌(B.subtilis)Z54之后，降低了番茄根系土壤中細菌群落的豐富度和多樣性指數且結果顯著(P<0.05)，表明添加Z54對土壤細菌群落的α多樣性有顯著影響。此外，β多樣性分析結果表明，添加Z54組改變了土壤細菌群落的β多樣性，土壤細菌群落結構產生了差異性變化。

　　Qiao等[26]的研究發現，根系定殖枯草芽孢桿菌PTS-394對番茄根系微生物群落也有過短暫影響變化，對細菌群落僅持續3d。然而Han等[27]在研究使用解淀粉芽孢桿菌B1408調節根系微生物群落來抑制黃瓜枯萎病時，結果發現細菌多樣性顯著增加;Wang等[28]的研究施用芽孢桿菌FKM10進行盆栽試驗，結果表明與對照組相比，處理組細菌豐富度和多樣性增加，土壤微生物群落結構發生變化。

　　在屬水平上，接種Z54處理主要使短波單胞菌屬(Brevundimonas)和黃桿菌屬(Flavobacterium)的相對豐度增加。孫卓等[29]從人參根系土壤分離得到的一株土壤短波單胞菌對人參銹腐病具有防治作用。Kwak等[30]基于宏基因組學分析從番茄根系鑒定和分離到一株黃桿菌，其能有效抑制番茄青枯病的發生。

　　因此，接種枯草芽孢桿菌(B.subtilis)Z54在一定程度上也提高了番茄根系有益微生物的相對豐度。 根系微生物發揮著重要的功能，如為植物提供營養、礦物質和維生素，并保護植物免受生物和非生物的脅迫，對于維持植物健康具有重要作用。土著根系微生物種群作為一種生態屏障，幫助植物抵御外來微生物的入侵。研究表明，微生物種群的多樣性和均勻性越高，抵抗環境脅迫和生物脅迫的能力往往越強。

　　外源植物促生菌可以通過提供養分、平衡植物激素狀態、誘導抗性、改變根系分泌物組成等方式改變根系微生物種群的組成和結構。Berg等[31]將外源促生菌調節植物根系微生物的作用歸納為6種類型：短暫的微生物群落變化;微生物多樣性的穩定或增加;微生物群落均勻度的穩定或增加;恢復微生態平衡;增加有益微生物;減少潛在的病原菌等。馬慧媛等[32]將含有哈茨木霉和巨大芽孢桿菌的菌劑接種到茄子根際，顯著提高了微生物群落的多樣性，并且提高了芽孢桿菌、假單胞菌等有益微生物的占比。本研究發現，接種促生菌Z54、JP2-3分別增加了不同有益微生物的相對豐度，但是降低了微生物群落的多樣性，尤其是Z54的影響更為顯著。

　　推測菌株Z54造成細菌群落顯著變化的原因是該菌株為高活性拮抗菌，能產生多種拮抗物質，對其他微生物產生了抑制作用，而基質的生態緩沖能力較弱，從而降低了微生物群落的豐富度和多樣性。基質中的微生物多樣性較低，生態平衡更容易被破壞，而在基質中接種促生菌可提高土著有益微生物的相對豐度，在促生菌和土著有益微生物的協同作用下，有利于預防病害發生、促進作物生長。

　　因此，在基質栽培條件下，接種促生菌對于維持作物健康、減少農藥化肥的使用具有重要意義。促生菌在作物根部的定殖、增殖和存活能力對于菌株促生和生防效果的穩定性具有重要影響[33]。由于擴展子測序技術的局限，本研究的結果只是對菌群的相對定量，未對接種的促生菌在番茄根際定殖水平進行絕對定量。

　　近期的一些研究進展對將來的研究提供了很好的參考，例如：Zhang等[34]通過AFLP鑒定出B.subtilisNCD-2和P.protegensFD6的特異片段，然后基于實時定量PCR技術建立了特異的檢測方法，研究了上述菌株在小麥根際的定殖情況;Guo等[35]報道了一種宿主相關定量豐度分析方法，該方法可以通過微生物標記基因與植物基因組的拷貝數比值，準確地檢測相對于宿主植物的微生物總量和根微生物組成員的定殖情況。

　　基于上述方法，可以更加準確地了解促生菌在植物根系的定殖情況以及根系微生物種群變化情況。綜上所述，在基質栽培條件下，施用假單胞菌(Pseudomonassp.)JP2-3和枯草芽孢桿菌(.subtilis)Z54促進了番茄生長。基質栽培番茄根系細菌群落組成在門水平上與土壤栽培相似，但在屬水平上有較大差異。

　　接種這2種促生菌改變了番茄根系細菌群落的α多樣性，群落的豐富度指數和多樣性指數都被降低，而且Z54處理組降低更顯著。兩種促生菌對番茄根系細菌群落的組成和結構產生了不同的影響，菌株Z54使番茄根系細菌群落多樣性發生了明顯變化，而菌株JP2-3對群落多樣性影響相對較小。接種2種促生菌，分別增加了不同土著有益微生物的相對豐度，有助于促進植物健康生長。上述結果是對基質栽培條件下促生菌微生態效應的初步探索，將來的研究可以通過宏基因組學和培養組學等多組學結合的手段研究根系微生態的功能，為闡明促生菌的作用機制提供重要信息。

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　　作者：李鳳1，周方園1，張廣志1，周紅姿1，吳曉青1，吳金娟2，張新建1

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