摘要為了評(píng)價(jià)草莓葉水提物(SLWE)延緩皮膚衰老功效，對(duì)SLWE成分、抗氧化活性、抑制非酶糖基化(NEG)能力進(jìn)行了測(cè)定;探討了SLWE對(duì)人包皮成纖維細(xì)胞(HFF-1)細(xì)胞活率、HFF-1中透明質(zhì)酸(HA)、人Ⅰ型膠原蛋白(COLⅠ)、羥脯氨酸(HYP)、基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)含量的影響。在中波紫外線(UVB)致HFF-1損傷模型基礎(chǔ)上，考察了SLWE對(duì)保護(hù)組活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、MMP-1和超氧化物歧化酶(SOD)的影響，探討SLWE對(duì)UVB致HFF-1損傷保護(hù)機(jī)制。結(jié)果表明，SLWE富含VC、槲皮素、綠原酸、沒(méi)食子酸及兒茶素類(lèi)物質(zhì)，其中，槲皮素含量12.86mg/L，表兒茶素含量10.13mg/L。SLWE自由基清除能力良好，清除不同自由基能力依次為O2-•>DPPH>ABTS>亞鐵離子螯合>•OH;體積分?jǐn)?shù)為1%的SLWE水溶液對(duì)NEG的抑制率為87.17%;體積分?jǐn)?shù)大于3%的SLWE水溶液可提高HFF-1中HA、COLI和HYP含量(P<0.05)，體積分?jǐn)?shù)為6%的SLWE水溶液可降低MMP-1含量(P<0.01)，表明SLWE具有提升皮膚含水量，增加膠原含量，抑制膠原降解，實(shí)現(xiàn)延緩衰老的功效;SLWE可有效降低因UVB刺激而產(chǎn)生的ROS，體積分?jǐn)?shù)6%的SLWE水溶液可顯著降MDA，抑制MMP-1表達(dá)，提高SOD活力，說(shuō)明SLWE有助于緩解氧化應(yīng)激造成的細(xì)胞損傷。

　　關(guān)鍵詞草莓葉水提物;UVB;人包皮成纖維細(xì)胞;損傷保護(hù);延緩衰老;醫(yī)藥與日化原料

　　成纖維細(xì)胞分泌的膠原纖維、彈性纖維及基質(zhì)成分，對(duì)維持皮膚正常生理狀態(tài)具有重要意義。皮膚經(jīng)紫外線長(zhǎng)期或大量照射后，會(huì)引發(fā)光損傷[1]，UVB刺激皮膚產(chǎn)生過(guò)多活性氧(ROS)，激活細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，脂質(zhì)、蛋白質(zhì)氧化、線粒體及DNA受損、細(xì)胞膜通透性改變，成纖維細(xì)胞周期停滯和凋亡，進(jìn)而引起皮膚細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白、彈性蛋白及透明質(zhì)酸降解，造成組織損傷，加速皮膚老化[1-2]。

　　目前，針對(duì)草莓的精深加工主要集中在草莓果實(shí)，而草莓葉作為草莓生產(chǎn)過(guò)程的副產(chǎn)品，大多采用填埋、焚燒等處理方式，存在環(huán)境污染等問(wèn)題。針對(duì)不同葉齡的草莓葉制作的草莓葉保健茶研究發(fā)現(xiàn)，其含有大量VC、鞣花酸、可溶性糖、原花青素、槲皮素、兒茶素、游離氨基酸等，尤其是VC，其含量可高達(dá)每百克葉片160~170mg[3-4]，具有良好的抗氧化活性及延緩衰老功效。但目前針對(duì)草莓葉提取物相關(guān)功效評(píng)價(jià)的研究較少，作用機(jī)制不明確。本研究制備了草莓葉水提物(SLWE)，并對(duì)其進(jìn)行成分測(cè)定、抗氧化及延緩衰老功效評(píng)價(jià)，同時(shí)探討SLWE對(duì)UVB致成纖維細(xì)胞損傷保護(hù)機(jī)制，為其在延緩皮膚衰老方面的應(yīng)用提供依據(jù)，推動(dòng)草莓副產(chǎn)品價(jià)值的深入挖掘和應(yīng)用。

　　1實(shí)驗(yàn)部分

　　1.1材料、試劑與儀器

　　草莓(Fragaria×ananassa)葉片，北京欣寶萊科技有限公司提供。甲醇、乙腈、乙酸、pH2.5磷酸水溶液(色譜級(jí))，鹽酸氨基胍、牛血清白蛋白(BSA)、葡萄糖、甲醇、醋酸鈉、無(wú)水三氯化鐵(FeCl3)、七水合硫酸亞鐵(FeSO4•7H2O)(以上均為AR)，美國(guó)Sigma-Aldrich公司;DMEM高糖培養(yǎng)基、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，美國(guó)Hyclone公司;青鏈霉素混合液(100×)、胰酶-EDTA、小牛血清(FBS)(以上均為AR)，美國(guó)ThermoFisher公司;CellCountingKit(CCK-8)試劑盒、活性氧(ROS)試劑盒、總SOD活性檢測(cè)試劑盒(WST-8法)、透明質(zhì)酸(HA)試劑盒，碧云天生物技術(shù)公司;丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒、羥脯氨酸(HYP)試劑盒，南京建成生物研究所;人I型膠原(COLI)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒、人基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP-1)試劑盒、人基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)試劑盒，武漢華美生物有限公司;人包皮成纖維細(xì)胞(HFF-1)，中國(guó)科學(xué)院干細(xì)胞庫(kù);去離子水，自制。

　　Agilent1220InfinityII液相色譜系統(tǒng)，AgilentZORBAXEclipsePlusC18柱(250mm×4.6mm×5µm)，AgilentZORBAXSB-Aq柱(250mm×4.6mm×5µm)，安捷倫科技(中國(guó))有限公司;InfiniteM200PRO酶標(biāo)儀，瑞士Tecan公司;IX73研究級(jí)熒光倒置顯微鏡，奧林巴斯(中國(guó))有限公司;LGJ-18真空冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司;EB-160C/FC手持式紫外燈，美國(guó)Spectroline公司。

　　1.2SLWE制備將新鮮草莓葉置于真空冷凍干燥機(jī)中，在真空度100Pa，功率1400W，-60℃條件下，干燥24h，冰上磨粉，過(guò)100目篩，得到草莓葉凍干粉。按料液比1:20(g:mL)加入草莓葉凍干粉和去離子水，在常溫(20℃)，60Hz條件下超聲輔助浸提0.5h后，于8000r/min離心10min，離心處理2次，取黃綠色上清液，即為SLWE，用孔徑為0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，備用。

　　1.3SLWE成分測(cè)定利用高效液相色譜儀對(duì)SLWE成分進(jìn)行測(cè)定，主要依據(jù)國(guó)標(biāo)或衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中的方法。以VC為例，其測(cè)試原理為：以VC標(biāo)準(zhǔn)品和去離子水制備不同質(zhì)量濃度的VC標(biāo)準(zhǔn)工作液，再對(duì)測(cè)試樣以色譜峰的保留時(shí)間定性，通過(guò)外標(biāo)法對(duì)其進(jìn)行定量。按照GB5009.86—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中抗壞血酸的測(cè)定》第一法測(cè)定VC含量;按照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范(2003年版)》保健食品功效成分及衛(wèi)生指標(biāo)檢驗(yàn)規(guī)范第二部分(十六)測(cè)定槲皮素含量;按照GB/T22250—2008《保健食品中綠原酸的測(cè)定》測(cè)定綠原酸含量;按照GB/T8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類(lèi)含量的檢測(cè)方法》測(cè)定沒(méi)食子酸和兒茶素類(lèi)含量。

　　1.4SLWE抗氧化活性測(cè)定

　　1.4.1還原力測(cè)定

　　采用鐵離子還原/抗氧化能力(FRAP)法[5]，以0.1mmol/LTrolox為陽(yáng)性對(duì)照，以自制去離子水稀釋?zhuān)瑴y(cè)定SLWE(體積分?jǐn)?shù)分別為0.01%、0.1%、1.0%、2.5%、5.0%、10.0%)水溶液的FRAP值。

　　1.4.2自由基清除能力測(cè)定

　　以自制去離子水稀釋?zhuān)�以VC(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%)水溶液為陽(yáng)性對(duì)照，參照XIE等[6]方法測(cè)定SLWE(體積分?jǐn)?shù)分別為0.10%、0.25%、1.00%、2.50%、10.0%、100.00%)水溶液的DPPH•清除能力;參照RE等[7]方法測(cè)定SLWE(體積分?jǐn)?shù)分別為0.10%、0.25%、1.00%、10.00%、100.00%)水溶液的ABTS•清除能力;采用鄰苯三酚自氧化法[5]，測(cè)定SLWE(體積分?jǐn)?shù)分別為0.10%、0.25%、1.00%、2.50%、10.00%)水溶液的O2-•清除能力。采用YOU等[8]方法測(cè)定SLWE(體積分?jǐn)?shù)分別為0.10%、1.00%、2.50%、10.00%、100.00%)水溶液的•OH清除能力;以EDTA-2Na(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01%)水溶液為陽(yáng)性對(duì)照，參考GÜLÇIN[9]方法測(cè)定SLWE(體積分?jǐn)?shù)分別為0.10%、0.25%、1.00%、2.50%、10.00%)水溶液的金屬離子螯合能力。

　　1.5SLWE抑制非酶糖基化(NEG)能力

　　參考莊秀園[10]的方法，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1g/L的鹽酸氨基胍水溶液為陽(yáng)性對(duì)照，pH7.4PBS為空白對(duì)照，樣品自身熒光強(qiáng)度為樣品本底對(duì)照，以激發(fā)波長(zhǎng)370nm和發(fā)射波長(zhǎng)440nm檢測(cè)熒光強(qiáng)度，測(cè)定SLWE(體積分?jǐn)?shù)分別為0.1%、0.2%、1.0%、10.0%、100.0%)對(duì)NEG的抑制率，按式(1)計(jì)算。NEG抑制率/%=[1-(A樣品-A樣品本底)/A空白]×100(1)1.6SLWE對(duì)正常生長(zhǎng)HFF-1的影響1.6.1HFF-1細(xì)胞培養(yǎng)選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HFF-1置于DMEM高糖培養(yǎng)基[含10%胎牛血清(體積分?jǐn)?shù))、100U/mL青霉素鈉、100mg/L鏈霉素]，于37℃、5%CO2(體積分?jǐn)?shù))、飽和濕度進(jìn)行培養(yǎng)，每3d更換1次培養(yǎng)基。生長(zhǎng)約80%融合時(shí)，V〔0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胰酶〕:V(EDTA)=1:2培養(yǎng)基，進(jìn)行HFF-1傳代。

　　2結(jié)果與討論

　　2.1SLWE成分測(cè)定

　　采用高效液相色譜法對(duì)SLWE中的VC、槲皮素、綠原酸、沒(méi)食子酸及兒茶素類(lèi)進(jìn)行鑒定，SLWE富含VC、槲皮素、綠原酸、沒(méi)食子酸及兒茶素類(lèi)，槲皮素含量最高，達(dá)12.86mg/L，表兒茶素10.13mg/L。研究發(fā)現(xiàn)，兒茶素類(lèi)是草莓葉中的主要抗氧化劑之一[12]，同時(shí)草莓葉富含VC[13]、槲皮素[14-15]、沒(méi)食子酸[16-17]、綠原酸[18]等，均為已知抗氧化劑，說(shuō)明SLWE具有作為抗氧化劑的可能。

　　2.2SLWE抗氧化活性測(cè)定

　　2.2.1還原力測(cè)定

　　依據(jù)SLWE對(duì)Fe3+的還原力評(píng)價(jià)其抗氧化能力，擬合得到的FeSO4•7H2O回歸方程為y=0.3405x+0.0017(R2=0.998)。UVB損傷組HFF-1中MDA和MMP-1含量顯著提高，SOD酶活力顯著降低，說(shuō)明UVB對(duì)HFF-1有明顯損傷作用，同時(shí)影響HFF-1清除ROS。與UVB損傷組相比，體積分?jǐn)?shù)為6%的SLWE水溶液可顯著降低MDA含量，抑制MMP-1表達(dá)，提升SOD活力，并且呈現(xiàn)一定的劑量依賴(lài)性，說(shuō)明SLWE對(duì)UVB致HFF-1損傷具有保護(hù)作用，同時(shí)可顯著提高細(xì)胞抗氧化能力，緩解氧化應(yīng)激造成的細(xì)胞損傷。

　　醫(yī)學(xué)論文投稿刊物：《環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué)》(月刊)創(chuàng)刊于1984年，創(chuàng)辦近20年來(lái)，一直被中國(guó)職業(yè)醫(yī)學(xué)界列為最重要學(xué)術(shù)期刊之一。2001年由李改為雙月刊，2002年正式更名為《環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué)》。該刊載文量約40萬(wàn)以上。省部級(jí)以上(包括國(guó)際性科研基金項(xiàng)目資助，已先后獲獎(jiǎng)。

　　3結(jié)論

　　SLWE富含槲皮素、表兒茶素、VC等多種具有顯著抗氧化性成分，且具有良好的自由基清除能力。體積分?jǐn)?shù)大于0.3%的SLWE水溶液可有效去除細(xì)胞中的ROS，同時(shí)緩解由外源條件，如光照(UVB)等造成的細(xì)胞損傷，提高HA含量，提升皮膚含水量，為皮膚提供有利的組織環(huán)境;此外，SLWE具有促進(jìn)HYP和COLI表達(dá)，增加膠原含量，抑制MMP-1表達(dá)，減少膠原分解的功效，同時(shí)阻止膠原發(fā)生糖化反應(yīng)交聯(lián)變黃。因此，SLWE具有多角度全方位維持皮膚彈性、結(jié)構(gòu)和含水量，減少皮膚暗淡、松弛和皺紋。SLWE可作為一種良好的抗氧化和延緩衰老功效原料，可應(yīng)用于食品、保健品、化妝品等相關(guān)領(lǐng)域，促進(jìn)草莓葉“廢物利用”，挖掘草莓經(jīng)濟(jì)效益。

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　　作者：董坤1，翟文麗1，王蘭青2，何聰芬