摘 要：采用薄層色譜(thin layer chromatography，TLC)法對樣品中的甲基麥冬黃烷酮 A 進行定性鑒別以示區(qū)別山麥冬;參照 2020 版《中國藥典》附錄相關方法，測定樣品中總灰分、干燥失重和重金屬;參照《食品安全國家標準》相關方法，測定樣品中菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)、大腸菌群和沙門氏菌;采用紫外 -可見分光光度(ultraviolet and visible spectrophotometry，UV)法測定樣品中總皂苷和總黃酮含量;采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法測定樣品中麥冬皂苷 D 含量。結果表明，薄層色譜中供試品與對照品在相同位置顯相同顏色的熒光斑點。總灰分為 0.695% ～ 0.857%，干燥失重為 8.074% ～9.013%，銅含量為 15.024 ～ 16.037mg/kg，鉛含量為 0.728 ～ 0.826mg/kg，砷含量為 0.662 ～ 0.815mg/kg，汞含量為 0.073 ～ 0.087mg/kg，鎘含量為 0.166 ～ 0.182mg/kg;菌落總數(shù)均小于 103 CFU/g，霉菌和酵母菌數(shù)均小于 102 CFU/g，未檢出大腸桿菌和沙門氏菌;總黃酮含量為 9.17 ～ 10.12mg/kg，總皂苷含量為 31.70 ～32.99mg/kg;麥冬皂苷 D 含量為 0.287 ～ 0.308mg/kg。質(zhì)量標準檢測方法可控性高、可操作性和專屬性強，可為于川麥冬須根提取物的質(zhì)量控制提供理論基礎。

　　關鍵詞：川麥冬須根;提取物;薄層色譜法;高效液相色譜法;質(zhì)量標準

　　麥 冬 為 百 合 科 植 物 麥 冬(Ophiopohonjaponicus(L.f)Ker-GawL.)的干燥塊根，為臨床常用中藥，具有養(yǎng)陰生津、潤肺清心功效，用于治療肺燥干咳、陰虛勞嗽、喉痹咽痛、內(nèi)熱消渴等癥[1]。麥冬化學成分主要為甾體皂苷類、高異黃酮類和多糖類等成分，其中前兩者是麥冬的主要活性部位[2-3]，具有降血糖、保護心血管系統(tǒng)、增強免疫、抗炎、抗腫瘤、延緩皮膚衰老等作用[4-10]。四川省三臺縣和浙江杭州筧橋一帶分別作為川麥冬和浙麥冬的道地產(chǎn)區(qū)，其中以川麥冬產(chǎn)量最大。大量研究表明，麥冬須根活性成分、藥理作用與塊根相似，總皂苷和多糖含量高于塊根[11-14]，傳統(tǒng)加工過程中麥冬須根的棄用造成了極大資源浪費。2019 年 4 月，四川省發(fā)布了《麥冬須根食品安全地方標準》[15]，正式將川麥冬須根列為新資源食品，在大健康理念的背景下，麥冬須根在藥食同源、保健食品方面顯示出極大的開發(fā)價值及應用前景。

　　當前，有關川麥冬須根提取物的質(zhì)量標準尚未見相關報道，研究擬在研制出川麥冬須根提取物的基礎上[16-17]，對其進行規(guī)范化的質(zhì)量標準研究，以期為川麥冬須根提取物產(chǎn)業(yè)化有效控制質(zhì)量提供科學依據(jù)。

　　1 材料與方法

　　1.1 試劑與材料

　　川麥冬及其須根采收于四川省三臺縣花園鎮(zhèn)麥冬種植基地，經(jīng)四川中醫(yī)藥高等專科學校金虹教授鑒定為百合科植物麥冬(Ophiopogonjaponicus(L.f.)Ker-Gawl.)及其須根。川麥冬須根提取物為須根經(jīng)水和乙醇提取、濃縮和純化、精制加工制成的黃棕色粉末。蘆丁(純度≥ 98%)、魯斯可皂苷元(純度≥ 98%)、山麥冬藥材：中國食品藥品檢定研究院;甲基麥冬黃烷酮 A(純度≥ 98%)、麥冬皂苷 D(純度≥ 98%)：成都曼思特生物科技有限公司;乙腈(色譜純)：國藥集團化學試劑有限公司;三氯甲烷、甲醇、石油醚、乙酸乙酯、乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、高氯酸(分析純)：成都科隆化學品有限公司;水為超純水。

　　1.2 儀器與設備

　　LC1525 型高效液相色譜儀(配有蒸發(fā)光檢測器及 Labsolutions 工作站)：美國 Waters 公司;UV-1100 型紫外 - 可見分光光度計：中國上海天美科技有限公司;BP121S 型電子分析天平：北京 Sartorius 天平有限公司;SB-3200DTDN 型超聲波清洗器：寧波新芝生物科技股份有限公司;W202B 型數(shù)控恒溫浴鍋：上海申勝生物技術有限公司;BPH-9042 恒溫培養(yǎng)箱：上海儀天科學儀器有限公司;LB-JL2 菌落計數(shù)器：青島路博偉業(yè)環(huán)保科技有限公司。

　　1.3 試驗方法

　　1.3.1 薄層色譜鑒別稱取川麥冬須根提取物 0.5g，加三氯甲烷 -甲醇(7∶3)混合溶液 20mL，超聲 30min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加三氯甲烷 0.5mL 使溶解，作為供試品溶液。分別稱取麥冬、山麥冬粉末各 2g，加三氯甲烷 - 甲醇(7∶3)混合溶液20mL，浸泡 3h，超聲 30min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加三氯甲烷 0.5mL 使溶解，作為對照藥材溶液。取甲基麥冬黃烷酮 A 對照品，加三氯甲烷制成 1mg/mL 的溶液，作為對照品溶液。按 2020 年版《中國藥典》(四部)通則 0502法[18]進行試驗：吸取麥冬供試品溶液、對照藥材溶液、對照品溶液各 6μL，分別點于同一硅膠GF254 預制板上，以石油醚(60 ～ 90℃)- 乙酸乙酯(8∶2，V/V)為展開劑，上行展開，展距為8cm。取出，晾干，置紫外光燈(波長 254nm)下檢視。

　　1.3.2 質(zhì)量標準測定

　　1.3.2.1 總灰分、干燥失重、微生物限度測定按照《中國藥典》2020 版四部通則 2302 法[18]和 0831 法[18]分別測定樣品中總灰分和干燥失重，每批樣品平行測定 2 次，取平均值。按照 GB 4789.2《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定》[19]規(guī)定的方法進行測定菌落總數(shù);按照 GB 4789.5《食品安全國家標準食品微生物學檢驗霉菌和酵母計數(shù)》[20]規(guī)定的方法進行測定霉菌和酵母菌總數(shù);按照 GB4789.3《食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸菌群計數(shù)》[21]規(guī)定的方法進行測定大腸菌群;按照 GB4789.4《食品安全國家標準食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》[22]規(guī)定的方法進行測定沙門氏菌。

　　1.3.2.2 重金屬測定按照《中國藥典》2020 版四部通則 2321 法[18]分別進行銅、鉛、砷、汞和鎘的含量測定，每批樣品平行測定 2 次，取平均值。

　　1.3.3 總黃酮含量測定稱取約 100mg 川麥冬須根提取物(精確至0.1mg)，置于容量瓶中，加蒸餾水，超聲溶解，定容至 25mL，搖勻，精密吸取儲備液 5mL，加水定容至 25mL，得供試品溶液。精密稱取蘆丁對照品適量，置于 25mL 容量瓶中，加 5mL 甲醇溶解，用蒸餾水定容至 25mL，制成濃度為250μg/mL 的對照品溶液。分別吸取對照品和供試品溶液各 4mL 置于25mL 容 量 瓶 中， 加 入 30% 的乙醇溶液 8mL，加入 5% 的亞硝酸鈉溶液 0.7mL，搖勻，放置5min，加入 10% 硝酸鋁溶液 0.7mL，5min 后加入 1mol/L 的氫氧化鈉 5mL，搖勻，用 30% 的乙醇溶液定容，放置 10min。以同批次試劑為空白，按照紫外 - 可見分光光度法(通則 0401)[18]，在 493nm 處測定吸光度。

　　1.3.4 總皂苷含量測定取本品粉末 0.1g，置 100mL 容量瓶中，加甲醇 70mL，超聲處理(功率 500W，頻率 40kHz)5min，冷卻，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。取魯斯可皂苷元對照品適量，精密量取，加甲醇制成 50μg/mL 的對照品溶液。精密量取對照品溶液 0.5、1、2、3、4、5、6mL，分別置具塞試管中，于水浴中揮干溶劑，精密加入高氯酸 10mL，搖勻，置熱水中保溫15min，取出，冰水冷卻，以相應的試劑為空白，參照紫外 - 可見分光光度法(通則 0401)[18]，在 397nm 波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。精密量取供試品溶液 3mL，置 10mL 具塞試管中，按照標準曲線的制備方法，自“于水浴中揮干溶劑”起，依法測定吸光度，從標準曲線計算得出樣品中總皂苷含量。

　　1.3.5 麥冬皂苷 D 含量測定

　　1.3.5.1 供試品溶液的制備 稱取約 100mg 川麥冬須根提取物(精確至 0.1mg)，置于容量瓶中，加蒸餾水，超聲溶解，定容至 25mL，搖勻，精密吸取儲備液 5mL，加水定容至 25mL，即得。

　　1.3.5.2 對照品溶液的制備 精密稱取麥冬皂苷 D 對照品適量，置于 25mL 容量瓶中，加甲醇5mL 溶解，用蒸餾水定容，制成濃度為 520μg/mL的對照品液，搖勻，即得。

　　1.3.5.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱：Alltima C18(250×4.6mm，5μm); 流 動 相∶乙 腈 - 水(52∶48，V/V); 柱 溫：30 ℃;流速：1.0mL/min;漂移管溫度：65℃ ;氣體流速：2.5mL/min;進樣量：20μL。分別取供試品溶液和對照品溶液，按上述色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。

　　1.3.5.4 線性關系考察 精密量取對照品溶液0.4、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL，分別置10mL 容量瓶中，加甲醇定容。按“1.3.5.3”項下色譜條件測定，以對照品質(zhì)量濃度 X(μg/mL)為橫坐標、峰面積 Y 為縱坐標進行線性回歸。

　　1.3.5.5 定量限與檢測限考察 按 2020 年 版《中國藥典》(二部)中關于檢測限與定量下限的要求，將麥冬皂苷 D 自標準曲線最低濃度20.8μg/mL 向下逐級稀釋，按“1.3.5.3”項下色譜條件進樣分析。結果麥冬皂苷 D 的檢測限(信噪比為 3)為 0.04μg/mL，定量下限為 0.1μg/mL，可滿足樣品測定靈敏度要求。

　　1.3.5.6 精密度試驗 取麥冬皂苷 D 對照品溶液，按“1.3.5.3”項下色譜條件重復進樣 6 次，記錄峰面積。

　　1.3.5.7 穩(wěn)定性試驗 取川麥冬須根提取物約100mg，精密稱定，按“1.3.5.1”項下方法制備供試品溶液后，分別在室溫下放置 0、2、4、6、12、24h，按“1.3.5.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。

　　1.3.5.8 重復性試驗 取川麥冬須根提取物 6 份，每份約 100mg，按“1.3.5.1”項下方法制備供試品溶液，按“1.3.5.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按回歸方程計算含量。

　　1.3.5.9 加樣回收率試驗 取川麥冬須根提取物 6 份，每份約 50mg，精密稱定，每份中精密加入與樣品中含量等量的麥冬皂苷 D 對照品，按“1.3.5.1”項下方法制備供試品溶液，然后按“1.3.5.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算其回收率。

　　1.3.5.10 樣品測定 分別取各批次樣品 100mg，精密稱定，按“1.3.5.1”項下方法制備供試品溶液，按“1.3.5.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，按標準曲線法計算含量，每批樣品重復測定 2 次。

　　2 結果與分析

　　2.1 薄層色譜鑒別麥冬藥材、川麥冬須根提取物均與對照品色譜相應位置上顯相同顏色的熒光斑點，斑點清晰，Rf 為 0.65，而山麥冬藥材無相應熒光斑點。

　　2.2 總灰分、干燥失重、微生物限度測定檢 測 結 果 顯 示， 所 測 10 批樣品總灰分為 0.695% ～ 0.857%，干燥失重為 8.074% ～9.013%;菌落總數(shù)每克均少于 1000 個，霉菌和酵母菌數(shù)每克均少于 100 個，大腸桿菌、沙門氏菌均未檢出，所測樣品均符合《中國藥典》2020 版及《食品安全國家標準》的相關規(guī)定。建議以平均值上浮約 20% 暫定川麥冬須根提取物總灰分不得超過 1%，干燥失重不得超過 11%。

　　2.3 重金屬測定測定結果顯示，銅含量為 15.024 ～ 16.037mg/kg，鉛含量為 0.728 ～ 0.826mg/kg，砷含量為 0.662 ～ 0.815mg/kg，汞含量為 0.073 ～ 0.087mg/kg，鎘含量為 0.166 ～ 0.182mg/kg。所測樣品均符合《中國藥典》2020 版及《食品安全國家標準》的相關規(guī)定，結果見表 2。建議以平均值上浮約 20% 暫定銅不得超過 20mg/kg，鉛不得超過1mg/kg，砷不得超過 1mg/kg，汞不得超過 0.1mg/kg，鎘不得超過 0.2mg/kg。

　　2.4 總黃酮、總皂苷含量測定測定結果顯示，總黃酮含量為 9.17 ～ 10.12mg/kg，總皂苷含量為 31.70 ～ 32.99mg/kg，結果見表 3。建議以最低值下浮約 20% 暫定總黃酮不得低于 8mg/kg，總皂苷不得低于 30mg/kg。

　　2.5 麥冬皂苷 D 含量測定

　　2.5.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗色譜圖。結果顯示，樣品中麥冬皂苷 D的保留時間約為 6.9min，與其余色譜峰的分離度均大于 1.5，理論板數(shù)以麥冬皂苷 D 計大于 6000。

　　2.5.2 線性關系考察麥冬皂苷 D 得回歸方程為 Y=1.7824X+1.573(r=0.9993)，表明麥冬皂苷 D 質(zhì)量濃度在 20.8 ～520μg/mL 范圍內(nèi)線性關系良好。

　　2.5.3 精密度、穩(wěn)定性、重復性、加樣回收率考察精密度試驗結果：麥冬皂苷 D 峰面積的 RSD為 0.67%(n=6)，表明儀器精密度良好;穩(wěn)定性試驗結果：樣品中麥冬皂苷 D 峰面積的 RSD 為1.01%(n=6)，表明樣品溶液在室溫下放置 24h內(nèi)穩(wěn)定;重復性試驗結果：樣品中麥冬皂苷 D 的平均含量為 0.308%，RSD 為 1.73%(n=6)， 表明該方法重復性良好。加樣回收率結果：麥冬皂苷 D 的平均回收率為 101.584%，RSD 為 2.03%(n=6)，表明方法準確度良好。

　　3 結論

　　麥冬指標性成分主要為甾體皂苷類和高異黃酮類，而麥冬皂苷 D 作為其主要甾體皂苷之一，與麥冬最新研究報道的功效密切相關，故將總皂苷、總黃酮和麥冬皂苷 D 含量共同作為質(zhì)量控制指標，與 2020 版《中國藥典》中麥冬以單一總皂苷含量作為質(zhì)量控制指標相比更為全面，具有較大提升。薄層色譜試驗證實了山麥冬屬植物不含或很少含沿階草屬植物麥冬的特征性成分(高異黃酮類化合物)，同時可對山麥冬須根提取物等代用品、混淆品進行有效鑒別，保證川麥冬須根原料來源。皂苷類成分極性較大，結構復雜，無紫外吸收，并且其測定經(jīng)常受麥冬多糖的干擾，采用紫外檢測方法，靈敏度低且有干擾峰，不易測定，故采用蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)，利用 HPLC法測定。

　　基于充分的化學研究和定性、定量分析，首次建立的川麥冬須根提取物的質(zhì)量控制方法和標準，涉及薄層色譜鑒別、檢查(總灰分和干燥失重)，總黃酮和總皂苷的 UV 含量測定，以麥冬皂苷 D 為指標成分的 HPLC 含量測定。川麥冬須根提取物的質(zhì)量控制方法和標準，通過了第三方(綿陽市食品藥品檢驗所)的復核驗證，3 批送檢樣品含量測定結果在單位之間的 RSD 在 3. 16%以下，表明本研究的檢測方法準確方便，重復性好，標準可行，可為于川麥冬須根提取物的質(zhì)量控制提供理論基礎。

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　　作者：何禮 1，金虹 1，*，湯丹丹 1，郭濤 2，黃毅 3，田仁君 1