摘要鳥(niǎo)嘌呤四鏈體(G鄄四鏈體)是一種特殊的核酸二級(jí)結(jié)構(gòu)，它可與高鐵血紅素結(jié)合，形成具有過(guò)氧化物酶活性的核酶;也可增強(qiáng)特殊結(jié)構(gòu)染料的熒光強(qiáng)度。G鄄四鏈體作為功能核酸中的一種，具有性質(zhì)穩(wěn)定、特異性好、功能多樣等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于各種生化分析中。本文對(duì)近年來(lái)G鄄四鏈體在生化分析中的研究和應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行了評(píng)述，對(duì)其應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

　　關(guān)鍵詞G鄄四鏈體;功能核酸;核酶;生化分析;評(píng)述

　　1引言

　　隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，特定核酸、蛋白、酶等的檢測(cè)，已成為某些疾病的直接或間接診斷指標(biāo)[1~3]。而傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，如高效液相色譜法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、免疫印跡法、電泳法[4~6]都涉及專(zhuān)業(yè)人員操作以及大型儀器的使用，存在檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、操作復(fù)雜、檢測(cè)靈敏度不高等問(wèn)題。而比色法及熒光法[7，8]作為儀器分析中的經(jīng)典方法，重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單，易于試劑盒的開(kāi)發(fā)。比色法或熒光法中如何高效穩(wěn)定輸出信號(hào)的報(bào)告分子是分析方法的研究熱點(diǎn)。功能核酸鳥(niǎo)嘌呤四鏈體(G鄄四鏈體)的特殊理化性質(zhì)，如與高鐵血紅素結(jié)合生成具有過(guò)氧化物酶活性的核酶、增強(qiáng)特殊結(jié)構(gòu)染料的熒光強(qiáng)度等，可靈活地實(shí)現(xiàn)信號(hào)的穩(wěn)定輸出。

　　利用G鄄四鏈體作為報(bào)告分子，與各種功能核酸或核酸信號(hào)放大方法聯(lián)用，可實(shí)現(xiàn)多種目標(biāo)分子高特異性、高靈敏的檢測(cè)，為多種生化分析提供快速、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法。本文首先介紹了G鄄四鏈體的分類(lèi)和功能，以及利用其與金屬離子作用引起的結(jié)構(gòu)變化而導(dǎo)致性質(zhì)的變化，結(jié)合特定染料或藥物分子的性質(zhì)，與其它功能核酸聯(lián)用等，在小分子、蛋白質(zhì)、酶、金屬離子、目標(biāo)DNA或RNA檢測(cè)、細(xì)胞成像及癌癥治療等方面應(yīng)用的研究進(jìn)展進(jìn)行了評(píng)述。

　　2G鄄四鏈體簡(jiǎn)介

　　2.1G鄄四鏈體的分類(lèi)

　　鳥(niǎo)嘌呤平面是由4個(gè)鳥(niǎo)嘌呤通過(guò)氫鍵構(gòu)成的方形平面，G鄄四鏈體由幾個(gè)鳥(niǎo)嘌呤平面堆疊而成，其結(jié)構(gòu)由處于平面之間的金屬離子形成穩(wěn)定金字塔結(jié)構(gòu)[9]。中心穩(wěn)定離子為一價(jià)或者二價(jià)金屬離子，其中K+是最常見(jiàn)的金屬離子，金屬離子的大小決定G鄄四鏈體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[10，11]。根據(jù)形成G鄄四鏈體的DNA或RNA鏈的數(shù)目分類(lèi)，由一條鏈形成四鏈體結(jié)構(gòu)稱(chēng)為分子內(nèi)G鄄四鏈體，多條鏈構(gòu)成的稱(chēng)為分子間G鄄四鏈體。根據(jù)鏈的走向可分為3類(lèi):當(dāng)四條鏈的方向均相同時(shí)，為平行結(jié)構(gòu);當(dāng)兩條鏈方向相同，另兩條鏈與其方向相反時(shí)，為反平行結(jié)構(gòu);其它情況稱(chēng)為混合平行結(jié)構(gòu)[12，13]。

　　G鄄四鏈體的結(jié)構(gòu)可通過(guò)圓二色譜測(cè)定。所有的G鄄四鏈體結(jié)構(gòu)在210nm處都有一個(gè)正的特征吸收峰。平行結(jié)構(gòu)的G鄄四鏈體在240nm處有一個(gè)負(fù)吸收峰，在260nm附近有一個(gè)正吸收峰;反平行結(jié)構(gòu)的G鄄四鏈體在260nm處有一個(gè)負(fù)吸收峰，在290nm處有一個(gè)正吸收峰[14]。G鄄四鏈體的結(jié)構(gòu)主要取決于DNA或RNA的序列、核酸鏈的濃度和穩(wěn)定離子的種類(lèi)[15]。以穩(wěn)定離子種類(lèi)為例，Kong等[16]發(fā)現(xiàn)同樣的序列在K+或Na+條件下形成不同的結(jié)構(gòu)，他們系統(tǒng)研究了以T為間隔的堿基序列(5憶鄄G3TiG3TjG3TkG3鄄3憶)。當(dāng)T的總數(shù)目臆5時(shí)，在100mmol/L的K+和Na+條件下均形成平行結(jié)構(gòu);當(dāng)T的總數(shù)目為6~7時(shí)，在K+存在下依然形成平行結(jié)構(gòu)G鄄四鏈體;而Na+穩(wěn)定時(shí)折疊成混合平行結(jié)構(gòu)。Li等[17]發(fā)現(xiàn)，PW17在K+存在下形成平行結(jié)構(gòu)G鄄四鏈體，而Pb2+條件下為反平行結(jié)構(gòu)。

　　2.2G鄄四鏈體的性質(zhì)

　　2.2.1G鄄四鏈體構(gòu)成的模擬酶

　　具有酶催化活性的DNA或RNA稱(chēng)為核酶(DNAzyme/RNAzyme)[18]。目前已發(fā)現(xiàn)具有切割或連接DNA/RNA、模擬過(guò)氧化物酶等活性的核酶[19~21]。G鄄四鏈體與輔因子高鐵血紅素(Hemin)結(jié)合形成具有過(guò)氧化物酶活性的核酶，可催化多種底物的氧化，包括ABTS、TMB、Am鄄plexRed、魯米諾等。這種核酶是Travascio等[22]在篩選可特異結(jié)合N鄄甲基化卟啉IX的核酸適配體時(shí)發(fā)現(xiàn)的，而后進(jìn)一步優(yōu)化得到18個(gè)堿基的核酸適配體PS2.M。PS2.M形成的G鄄四鏈體與Hemin構(gòu)成的核酶，其催化活性是Hemin單獨(dú)存在時(shí)的250倍[23]。此類(lèi)核酶的催化反應(yīng)機(jī)理與辣根過(guò)氧化物酶類(lèi)似，G鄄四鏈體模擬辣根過(guò)氧化物酶中的組氨酸殘基為Hemin中的Fe提供一個(gè)軸向配體和一個(gè)疏水環(huán)境，有利于OO的異裂。

　　G鄄四鏈體為Hemin提供一個(gè)平面結(jié)構(gòu)，有利于氫的交換[24~26]。目前，對(duì)于此類(lèi)核酶的活性調(diào)控主要有3種方法:(1)是改變G鄄四鏈體本身的序列，從而改變其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)來(lái)影響其性質(zhì);(2)是改變穩(wěn)定中心離子，從而改變G鄄四鏈體的構(gòu)型而改變Hemin的結(jié)合情況;(3)是在G鄄四鏈體的序列末端增加腺嘌呤，可將其活性提高至原有活性的4倍[24]。另外，還可加入ATP來(lái)穩(wěn)定催化過(guò)程中產(chǎn)生的自由基，提高催化效率[27]。

　　2.2.2G鄄四鏈體增強(qiáng)熒光的染料

　　G鄄四鏈體可結(jié)合一些特定的熒光染料，極大地增強(qiáng)染料自身的熒光強(qiáng)度，例如卟啉衍生物、酞菁染料、結(jié)晶紫、三苯甲烷等染料。熒光增強(qiáng)的原理是G鄄四鏈體可為染料分子提供一個(gè)疏水環(huán)境，防止熒光分子的相互靠近導(dǎo)致的自淬滅現(xiàn)象。結(jié)晶紫(Crystalviolet，CV)是一種三苯甲烷染料，堆積在兩個(gè)鳥(niǎo)嘌呤平面之間，可區(qū)分平行和反平行G鄄四鏈體。反平行G鄄四鏈體的Loop環(huán)可結(jié)合CV使其不受溶劑的影響，使得熒光大大增強(qiáng)。而平行G鄄四鏈體側(cè)鏈的Loop環(huán)不能結(jié)合CV，使得CV的熒光增強(qiáng)明顯弱于結(jié)合反平行G鄄四鏈體的CV[16]。硫磺素T(ThioflavinT，ThT)是一種水溶性染料，可特異性地識(shí)別并結(jié)合G鄄四鏈體，結(jié)合后其熒光強(qiáng)度可增大2500倍[28]。

　　(Z)鄄4鄄(3，5鄄difluoro鄄4鄄hydroxybenzylidene)鄄1，2鄄dimethyl鄄1H鄄imidazol鄄5(4H)鄄one(DFHBI)是一種可與RNAG鄄四鏈體結(jié)合并對(duì)其進(jìn)行特異性識(shí)別的染料分子，結(jié)合后可模擬綠色熒光蛋白的熒光，用于細(xì)胞中的RNA成像[29]。在此基礎(chǔ)上，F(xiàn)eng等[30]報(bào)道了6種與紅色熒光蛋白生色團(tuán)類(lèi)似的染料分子，與G鄄四鏈體結(jié)合后發(fā)出的熒光光譜范圍幾乎覆蓋紅色熒光蛋白的發(fā)射光譜，并且有較高的熒光量子產(chǎn)率，以此可模擬紅色熒光蛋白，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)成像。

　　2.2.3G鄄四鏈體降低電信號(hào)的電化學(xué)活性分子

　　亞甲基藍(lán)(Methyleneblue，MB)是一種帶正電的芳香結(jié)構(gòu)，是一種常用的電化學(xué)信號(hào)分子。Zhang等[31]研究發(fā)現(xiàn)，由于G平面的末端仔鄄仔堆疊效應(yīng)，MB可競(jìng)爭(zhēng)Hemin結(jié)合到G鄄四鏈體上，顯著減少擴(kuò)散到電極表面的MB，從而使得電流下降。

　　3G鄄四鏈體在生化分析中的應(yīng)用

　　3.1小分子與蛋白質(zhì)的檢測(cè)

　　核酸適配體是經(jīng)體外篩選，可高特異性和高親和力地識(shí)別并結(jié)合目標(biāo)分子的單鏈DNA或RNA。以G鄄四鏈體為信號(hào)分子檢測(cè)小分子和蛋白質(zhì)的傳感分析方法大多與核酸適配體單元聯(lián)用。如Willner研究組[32]將ATP的核酸適配體連接上一段G鄄四鏈體序列作為識(shí)別探針，另一條DNA與之部分雜交形成中間留有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的雙鏈結(jié)構(gòu)。當(dāng)ATP存在時(shí)，核酸適配體與ATP結(jié)合，識(shí)別探針從雙鏈上解離下來(lái)，釋放出的G鄄四鏈體與Hemin形成DNAzyme，催化底物反應(yīng)。利用類(lèi)似的設(shè)計(jì)，可實(shí)現(xiàn)可卡因、溶菌酶、細(xì)胞因子[33~35]等的檢測(cè)。

　　在此類(lèi)設(shè)計(jì)中，要求仔細(xì)篩選G鄄四鏈體和核酸適配體中被雙鏈結(jié)構(gòu)封閉的堿基數(shù)目，使得在有目標(biāo)分子條件下G鄄四鏈體可從雙鏈解離產(chǎn)生信號(hào)，而無(wú)目標(biāo)分子時(shí)，G鄄四鏈體不會(huì)自動(dòng)解離產(chǎn)生較高的背景信號(hào)。值得注意的，凝血酶有兩種長(zhǎng)度分別為15及29個(gè)堿基的核酸適配體，且都可形成G鄄四鏈體結(jié)構(gòu)。Li等[36]利用凝血酶的核酸適配體結(jié)合凝血酶后，可促進(jìn)核酸適配體形成的G鄄四鏈體，并更好地結(jié)合Hemin以提高DNAzyme的催化活性，從而實(shí)現(xiàn)凝血酶的檢測(cè)。

　　3.2酶活性的分析

　　酶是生命過(guò)程中不可或缺的一部分，各種疾病的發(fā)生都與酶活性的異常相關(guān)，因此酶活性的檢測(cè)是生化分析中的重要內(nèi)容。以G鄄四鏈體為信號(hào)分子分析酶活性的報(bào)道中，檢測(cè)對(duì)象大多是以核酸為底物的酶。以下介紹幾種在疾病診斷、分子生物學(xué)中有重要意義的酶的檢測(cè)方法。

　　3.2.1T4多聚核苷酸激酶(T4poly鄄nucleotidekinase，T4PNK)T4PNK是一種雙功能酶，可移除3憶磷酸基團(tuán)以恢復(fù)3憶羥基基團(tuán)，也可實(shí)現(xiàn)5憶磷酸化。Liu等[37]報(bào)道了一種基于G鄄四鏈體鄄DNAyzme比色檢測(cè)T4PNK的方法。在該體系中，設(shè)計(jì)了兩條探針，一條是3憶磷酸化的引物，一條是封閉有G鄄四鏈體序列的發(fā)夾探針。

　　當(dāng)T4PNK存在時(shí)，引物的3憶磷酸被去磷酸化，生成3憶羥基，此時(shí)聚合酶可將引物延伸打開(kāi)發(fā)夾，釋放G鄄四鏈體序列。該方法可檢測(cè)低至0.01U/mL的T4PNK�；�于T4PNK5憶磷酸化活性，裴仁軍研究組[38]設(shè)計(jì)了一種裂分的G鄄四鏈體DNAzyme檢測(cè)體系，實(shí)現(xiàn)最低濃度0.014U/mL的T4PNK的檢測(cè)。

　　3.2.2核酸外切酶芋(Exonuclease芋，Exo芋)Exo芋具有從3憶鄄5憶方向切割DNA的活性，在DNA復(fù)制等生理過(guò)程中有重要意義。Leung等[39]設(shè)計(jì)了發(fā)夾莖部含有G鄄四鏈體結(jié)構(gòu)的探針用于分析Exo芋的活性。核酸內(nèi)切酶芋從發(fā)夾莖部的3憶端切斷，最后剩下的單鏈部分即為G鄄四鏈體，與CV結(jié)合后大大增加其熒光，以此來(lái)檢測(cè)核酸內(nèi)切酶芋的活性。

　　3.2.3DNA連接酶(DNAligase)DNA連接酶能催化DNA分子內(nèi)或分子間毗鄰的5憶磷酸基團(tuán)和3憶羥基基團(tuán)形成磷酸二酯鍵，將兩段相鄰的DNA拼合成一條完整的DNA鏈。He等[40]利用DNA連接前后對(duì)于發(fā)夾結(jié)構(gòu)的改變，開(kāi)發(fā)了基于G鄄四鏈體檢測(cè)DNA連接酶的方法，最低可檢測(cè)0.2U/mL的DNA連接酶。

　　3.3金屬離子的檢測(cè)目前，金屬離子污染問(wèn)題日趨嚴(yán)重，開(kāi)發(fā)高效檢測(cè)金屬離子的方法，成為研究者關(guān)注的熱點(diǎn)。以G鄄四鏈體為信號(hào)分子的檢測(cè)方法可簡(jiǎn)單、高效、便捷地檢測(cè)金屬離子，按其檢測(cè)原理可分為三類(lèi)。

　　3.3.1特異性穩(wěn)定G鄄四鏈體的金屬離子利用中心離子穩(wěn)定的G鄄四鏈體構(gòu)型不同而實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。Li等[17]報(bào)道了一種基于G鄄四鏈體結(jié)構(gòu)變化檢測(cè)Pb2+的方法。PS2.M在K+存在時(shí)折疊成平行結(jié)構(gòu)的G鄄四鏈體，與Hemin結(jié)合后顯示較高的過(guò)氧化物酶活性。在Pb2+存在時(shí)，PS2.M折疊成反平行的G鄄四鏈體，不利于與Hemin的結(jié)合，過(guò)氧化物酶活性下降。根據(jù)K+與Pb2+穩(wěn)定的G鄄四鏈體的催化活性的差異，可實(shí)現(xiàn)二者的檢測(cè)(圖4A)。利用此原理，還可實(shí)現(xiàn)Tb3+[51]、Ba2+[52]等的檢測(cè)。此外，還有一類(lèi)特殊的例子，如利用Cu+能高效催化疊氮基團(tuán)與炔基的Click反應(yīng)，使得兩條裂分的DNA連接后能形成G鄄四鏈體結(jié)構(gòu)，加入取代鏈后可將完整的G鄄四鏈體序列置換下來(lái)，實(shí)現(xiàn)CV的熒光增強(qiáng)，對(duì)Cu2+進(jìn)行檢測(cè)，最低檢測(cè)濃度可達(dá)到65nmol/L[53]。

　　3.3.2與堿基作用的特定金屬離子利用特定金屬離子與堿基的作用實(shí)現(xiàn)金屬離子檢測(cè)，如T鄄Hg2+鄄T，C鄄Ag+鄄C結(jié)構(gòu)的形成。其中一類(lèi)是基于金屬離子與堿基作用后抑制G鄄四鏈體的形成(Turn鄄off模式)，另一類(lèi)是促進(jìn)G鄄四鏈體的形成(Turn鄄on模式)。Willner研究組報(bào)道了一種基于T鄄Hg2+鄄T的分子機(jī)器檢測(cè)Hg2+。Li等[55]報(bào)道了基于C鄄Ag+鄄C作用下，拉近兩條裂分的G鄄四鏈體序列，構(gòu)成完整G鄄四鏈體檢測(cè)Ag+，檢出限為2.5nmol/L。

　　4總結(jié)與展望

　　G鄄四鏈體作為一種功能核酸，具有性質(zhì)穩(wěn)定、特異性好、功能多樣等特點(diǎn)，被廣泛用于各種生化分析中。目前基于G鄄四鏈體開(kāi)發(fā)的分析檢測(cè)方法包括比色法、熒光法、電化學(xué)、電化學(xué)發(fā)光等多種形式。由于G鄄四鏈體結(jié)構(gòu)的特殊性，其被用于細(xì)胞成像以及癌癥治療等方面的研究。G鄄四鏈體未來(lái)主要的發(fā)展趨勢(shì)可能有以下方面:(1)提高模擬過(guò)氧化物酶的活性。目前的研究結(jié)果表明G鄄四鏈體構(gòu)成的核酶雖然可通過(guò)前文方法提高活性，但是對(duì)比蛋白酶的活性還是有很大差距。因此，提高核酶活性是重要的研究?jī)?nèi)容。(2)特異性識(shí)別的紅外染料的合成。隨著成像技術(shù)的發(fā)展，普通熒光成像面臨著高背景、易被光漂白等應(yīng)用方面的限制。開(kāi)發(fā)組織穿透能力高，結(jié)合G鄄四鏈體后能顯著增強(qiáng)熒光的染料，可拓展G鄄四鏈體在細(xì)胞成像方面的應(yīng)用。(3)便攜式傳感器的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用。目前，基于G鄄四鏈體的分析傳感方法多局限于實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用，開(kāi)發(fā)便攜式(如試紙類(lèi)、數(shù)顯類(lèi))直讀型便攜式商用傳感器將是未來(lái)的研究趨勢(shì)。

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