摘要為了解小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子mitf基因在魚類早期體色褪黑過程中的調(diào)控作用，本研究采用RACE技術(shù)獲得橘色雙冠麗魚(Amphilophuscitrinellus)mitf基因cDNA序列全長，利用qRT-PCR技術(shù)檢測其在橘色雙冠麗魚胚胎不同發(fā)育時期、體色褪黑不同時期和各個組織中的表達(dá)規(guī)律。獲得mitf基因2個亞型，其中，mitf1的cDNA全長為1816bp，包括5′非編碼區(qū)(UTR)158bp、3′UTR428bp、開放閱讀框(ORF)1230bp，共編碼409個氨基酸;mitf2的cDNA全長為1638bp，5´UTR長160bp，3´UTR長428bp，ORF長1050bp，共編碼349個氨基酸。同源性和系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，mitf1和mitf2聚在一小支，與慈鯛科(Cichlidae)魚類同源性最高，與哺乳類動物同源性較低。qRT-PCR結(jié)果顯示，在成魚各個組織中mitf1和mitf2均有不同程度表達(dá)，其中，眼部表達(dá)量最高且顯著高于其他組織(P<0.05)，肌肉、腦和腎臟也有較高表達(dá);mitf1和mitf2在胚胎各個發(fā)育時期均有表達(dá)，在受精卵時期表達(dá)量最高，顯著高于其他胚胎期;隨著橘色雙冠麗魚體色由黑色過渡到橘黃色，mitf1和mitf2在魚皮膚、鱗片、尾鰭中的表達(dá)均呈逐漸下降趨勢，表明mitf基因表達(dá)與魚體色由黑到黃轉(zhuǎn)變的表型間存在關(guān)聯(lián)性，推測與魚體色發(fā)育階段色素細(xì)胞的分化和分布比例的動態(tài)變化相關(guān)。本研究通過了解魚類體色發(fā)育和變異的分子基礎(chǔ)，可為魚類色素細(xì)胞發(fā)育和體色人工改良積累資料。

　　關(guān)鍵詞橘色雙冠麗魚;小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(MITF);qRT-PCR;黑色素細(xì)胞

　　MITF(Microphthalmia-associatedtranscriptionfactor)即小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，由Hertwig(1942)于放射誘導(dǎo)的突變小鼠中發(fā)現(xiàn)，突變體的后代會出現(xiàn)小眼畸形、早發(fā)性耳聾、皮毛和虹膜色素減退等癥狀。MITF是動物皮膚、眼睛和羽毛色素中黑色素細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)控因子(Linetal,2019)，具有基本–螺旋–環(huán)–亮氨酸拉鏈(Basichelix-loop-helix-leucinezipper,bHLHZip)結(jié)構(gòu)，以二聚體的形式與絡(luò)氨酸家族啟動子Mbox高度結(jié)合，通過直接調(diào)控dct、tyr、tyrp1、c-kit和bcl2等基因的表達(dá)，從而在黑色素細(xì)胞的發(fā)育、存活、遷移、增殖和分化過程中發(fā)揮重要作用(Steingrimssonetal,2004)。在哺乳動物中，mitf基因的突變或缺失可能會導(dǎo)致動物耳朵、眼睛、毛發(fā)、體色等表型發(fā)生改變，如鵪鶉(Coturnix)白色羽毛的產(chǎn)生(Minvielleetal,2010);馬(Equuscaballus)(Hauswirthetal,2019)和犬(Canislupusfamiliaris)(Korbergetal,2014)皮毛白色斑點的出現(xiàn)等。

　　在魚類中，mitf作為治療黑色素瘤潛在的靶基因，已在斑馬魚(Daniorerio)中開展了大量研究(Listeretal,2014)，在東方鲀(Lietal,2013)、錦鯉(Cyprinuscarpio)(Liuetal,2015)、鯽魚(Carassiusauratus,redvar.)(Zhangetal,2017)等魚類中也開展了mitfa在胚胎和各個成魚組織中表達(dá)情況的研究，初步探索了mitfa在魚類體色形成過程中的作用，但其具體的調(diào)控機制及與其他體色相關(guān)基因的聯(lián)級作用仍未被闡明。橘色雙冠麗魚(Amphilophuscitrinellus)，俗稱紅魔鬼，原產(chǎn)于中南美洲的尼加拉瓜、哥斯達(dá)黎加等地，是一種既可食用又可觀賞的大型熱帶魚類(Barluengaetal,2010;Kauttetal,2012)。通常1齡可達(dá)性成熟，成熟后的麗魚體色為橘紅色或橘色，生產(chǎn)上常將其作為父本與紅頭麗魚(Cichlasomasynspilum)雜交，產(chǎn)生更具觀賞性的子一代血鸚鵡魚(♂A.citrinellus×♀C.synspilum)。

　　橘色雙冠麗魚在發(fā)育過程中會出現(xiàn)體色過渡的現(xiàn)象，體色由最初黑色過渡至灰色，灰色再過渡至亮黃色，這一現(xiàn)象稱為體色褪黑(蔣燕玲,2016)，主要是由于色素細(xì)胞的形成、增殖、遷移和分化所致。橘色雙冠麗魚含4種色素細(xì)胞，包括黑色素細(xì)胞、黃色素細(xì)胞、紅色素細(xì)胞和虹彩細(xì)胞，其中，紅色素細(xì)胞和虹彩細(xì)胞只在特定部位分布且數(shù)量較少，黑色素細(xì)胞和黃色素細(xì)胞在“黑色–灰色–黃色”3個時期均有分布，孵化后至體色由黑到黃的轉(zhuǎn)變過程中，黑色素細(xì)胞數(shù)量呈逐漸增加而后又減少的趨勢，黃色素細(xì)胞數(shù)量則呈一直增加趨勢(韋敏俠等,2015)。

　　目前，國內(nèi)外對魚類早期體色褪黑這一復(fù)雜生物學(xué)過程的研究相對較少，其調(diào)控機制仍不明確。魚類體色的形成和分布主要是由其體表鱗片和皮膚中色素細(xì)胞的類型、分布和數(shù)量所決定(Shietal, 2015;Yuetal,2012)，目前，已在魚類中鑒定出6種色素細(xì)胞，包括黑色素細(xì)胞、黃色素細(xì)胞、紅色素細(xì)胞、虹彩細(xì)胞、白色素細(xì)胞和藍(lán)色素細(xì)胞(Volkeningetal,2018)。其中，黑色素細(xì)胞分布最為廣泛，含有大量的黑色素顆粒，能夠吸收特定波長的入射光，使魚的顏色呈現(xiàn)黑色/灰色(Zhangetal,2017)。

　　黑色素細(xì)胞起源于外胚層神經(jīng)嵴細(xì)胞，由神經(jīng)嵴細(xì)胞經(jīng)黑素母細(xì)胞、黑素干細(xì)胞發(fā)育至成黑色素細(xì)胞(Cohenetal,2016)，黑色素細(xì)胞的形成受一系列通路和基因的嚴(yán)格調(diào)控(Houetal,2008)，其中，MC1R/α-MSH信號通路(Newtonetal,2007)、PI3K/Akt信號通路(Khaledetal,2002)、MAPK信號通路(Wangetal,2017)、WNT/β-catenin信號通路(Yamadaetal,2010)、NO信號通路(Parketal,2009)為最常見的5條信號通路，mitf作為這5條通路共有的靶向基因，直接關(guān)聯(lián)黑色素細(xì)胞發(fā)育所必需的多個基因的表達(dá)，包括dct、tyr、c-kit和bcl2等，對黑色素細(xì)胞存活、遷移、增殖和分化起著關(guān)鍵性作用(Steingrimssonetal,2004)。本研究擬聚焦黑色素合成關(guān)鍵基因mitf，檢測其在橘色雙冠麗魚各組織、胚胎發(fā)育各時期和體色褪黑轉(zhuǎn)換期的表達(dá)模式，了解其在魚類體色褪黑調(diào)控中的作用規(guī)律。

　　1材料與方法

　　1.1實驗材料

　　橘色雙冠麗魚取自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所。選取性成熟且體色為橘色的健康雙親進(jìn)行配對，獲取不同發(fā)育時期的胚胎，包括受精卵、卵裂期、原腸期、神經(jīng)期、視泡期、聽泡期、心臟形成期、血液循環(huán)期等8個時期胚胎(蔣燕玲,2016)。在體色發(fā)育的3個褪色階段“黑色、灰白、黃色”各取3尾魚，剝離鱗片、皮膚和尾鰭。同樣選取性成熟且體色為淡黃色的橘色雙冠麗魚3尾，分離鰓、腦、肌肉、性腺、眼、腎、心臟等7個組織。所取材料均用Trizol保存，置于–80℃冰箱保存，用于RNA提取和熒光定量分析。

　　1.2實驗方法

　　1.2.1mitf基因

　　cDNA全長克隆取性成熟橘色雙冠麗魚皮膚、鱗片、尾鰭于Trizol中，按TissueRNAKit(OMEGA)試劑盒操作步驟提取總RNA，通過1%瓊脂糖凝膠電泳和SynergyTMNEOHTS多功能酶標(biāo)儀檢測RNA的完整性、純度及濃度。利用Prime ScriptTMⅡ1stStrandcDNASynthesisKit(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈，置于–20℃冰箱保存。根據(jù)已知慈鯛科(Cichlidae)魚類保守序列，利用Primer5.0軟件設(shè)計擴增引物mitf-F和mitf-R，以cDNA第一鏈為模板，擴增目的基因片段。

　　25μL擴增體系：16.75μLddH2O，4μLdNTPMIXS，2.5μL10×Buffer，0.5μL模板，上下游引物各0.5μL，0.25μLrTaq酶;反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，55℃退火60s，72℃延伸60s，35個循環(huán)，72℃后延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，擴增產(chǎn)物送廣州艾基生物有限公司進(jìn)行測序。

　　根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計mitf5′race和3′race巢氏引物，通過SmarterRace5′/3′KitComponents(TaKaRa)試劑盒進(jìn)行5′末端和3′末端序列擴增。擴增后PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收、連菌、37℃培養(yǎng)過夜，挑選陽性克隆進(jìn)行測序。利用軟件VectorNTI將mitf5′端、3′端及其中間序列拼接，從而獲得橘色雙冠麗魚完整mitfcDNA序列。

　　2結(jié)果

　　2.1橘色雙冠麗魚

　　mitf基因cDNA全長和氨基酸序列分析獲得橘色雙冠麗魚mitf基因2個亞型mitf1和mitf2，其中，mitf1cDNA全長為1816bp，5′UTR長158bp，3′UTR長428bp，開放閱讀框(ORF)為1230bp，共編碼409個氨基酸。預(yù)測其蛋白質(zhì)分子量為39.1kDa，理論等電點為5.23，親水性系數(shù)為–0.603。TMHMM2.0查找發(fā)現(xiàn)無跨膜結(jié)構(gòu)。磷酸化位點分析顯示，該蛋白包含27個絲氨酸(S)磷酸化位點、9個蘇氨酸(T)磷酸化位點、5個絡(luò)氨酸(Y)磷酸化位點。使用SOPAMA預(yù)測蛋白二級結(jié)構(gòu)，其中，α螺旋結(jié)構(gòu)131個(占37.01%)，β折疊22個(占6.21%)，無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)177個(占50%)，延展鏈結(jié)構(gòu)24個(占6.78%)。

　　mitf2的cDNA全長為1638bp，5′UTR長160bp，3´UTR長428bp，ORF為1050bp，共編碼349個氨基酸。預(yù)測其蛋白質(zhì)分子量為38.5kDa，理論等電點為5.23，親水系數(shù)為–0.645。mitf1和mitf2氨基酸序列比對結(jié)果顯示，mitf1亞型氨基酸序列與mitf2亞型相比，在0~53的位置多53個氨基酸，82~86的位置多5個氨基酸，其余位置完全相同。TMHMM2.0查找發(fā)現(xiàn)無跨膜結(jié)構(gòu)。

　　磷酸化位點分析顯示，該蛋白包含27絲氨酸(S)磷酸化位點、9個蘇氨酸(T)磷酸化位點、5個絡(luò)氨酸(Y)磷酸化位點。使用SOPAMA預(yù)測蛋白二級結(jié)構(gòu)，其中，α螺旋結(jié)構(gòu)142個(占40.69%)，β折疊14個(占4.01%)，無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)174個(占49.86%)，延展鏈結(jié)構(gòu)19個(占5.44%)。與mitf1蛋白二級結(jié)構(gòu)相比，除在0~53和82~86位置多出氨基酸及個別位點結(jié)構(gòu)不同外，二級結(jié)構(gòu)基本一致。

　　2.2mitf基因同源比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

　　橘色雙冠麗魚2個亞型mitf1和mitf2的bHLHzip結(jié)構(gòu)氨基酸序列與大多數(shù)物種高度一致，表明bHLHzip結(jié)構(gòu)在進(jìn)化過程中較為保守。利用MegAlign軟件分析橘色雙冠麗魚mitf基因氨基酸序列與其他物種的同源性，結(jié)果顯示，橘色雙冠麗魚mitf1氨基酸序列與斑馬擬麗魚(Maylandiazebra)、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)和薩伊藍(lán)六間(Cyphotilapiafrontosa)等魚類同源性最高，分別為90.7%、91.9%和93%，與其他硬骨魚類如大黃魚(Larimichthyscrocea)、斑魚(Channaargus)和孔雀魚(Poeciliareticulata)也有較高的同源性，分別達(dá)到了85.6%、87.4%和82.1%，而與人(Homosapiens)、黑猩猩(Pantroglodytes)、雞(Gallusgallus)和非洲爪蟾(Xenopuslaevis)則相對較低，只有60%、60.9%、58.9%和63.1%。

　　3討論

　　3.1mitf基因的cDNA全長和氨基酸序列分析

　　通過Race技術(shù)獲得橘色雙冠麗魚mitf基因cDNA全長，2個亞型MITF1和MITF2均具有3個結(jié)構(gòu)域：靠近N末端的MITF_TFEB_C_3_N結(jié)構(gòu)域、bHLHZip結(jié)構(gòu)域和一個未知功能結(jié)構(gòu)域(DUF3371)。bHLHZip結(jié)構(gòu)域作為MITF蛋白的功能區(qū)域，在進(jìn)化過程中高度保守，其中，HLHZip區(qū)域能夠與自身或色素細(xì)胞的形成、增殖、遷移和分化起著重要的調(diào)控作用，而mitfb不參與黑色素細(xì)胞的發(fā)育，只在眼色素上皮細(xì)胞中表達(dá)，參與眼調(diào)控的發(fā)育(Listeretal,2014)。

　　本研究克隆的mitf1和mitf2為mitf基因2個亞型，均屬于mitfa亞型，理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示，mitf1和mitf2的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)極為相似，熒光定量結(jié)果顯示，mitf1和mitf2除了在胚胎期表達(dá)量有差異外，在各個組織和各轉(zhuǎn)換時期表達(dá)量變化趨勢基本一致，因此，推測mitf1和mitf2更多地保留了mitfa基因功能，未出現(xiàn)明顯基因功能分化。同源比對發(fā)現(xiàn)，橘色雙冠麗魚mitf1、mitf2與尼加拉瓜湖始麗魚、薩伊藍(lán)六間、斑魚等魚類具有較高的同源性，與哺乳類、鳥類、爬行類等同源性較低，符合橘色雙冠麗魚傳統(tǒng)進(jìn)化地位。

　　3.2mitf基因表達(dá)差異分析

　　3.2.1mitf基因在胚胎發(fā)育時期的表達(dá)

　　mitf1和mitf2在橘色雙冠麗魚8個胚胎發(fā)育時期均有表達(dá)，其中，在受精卵時期表達(dá)量最高，顯著高于其他發(fā)育期(P<0.05)，表現(xiàn)出明顯的時期特異性。研究發(fā)現(xiàn)，mitf基因也在其他動物胚胎發(fā)育期開始表達(dá)，但表達(dá)的時期較晚，如非洲爪蟾胚胎在21/22期開始表達(dá)(Kumasakaetal,2010)，雞(Mochiietal,1998)和鼠(Musmusculus)(Nakayamaetal,1998)胚胎則在5日齡和9.5日齡開始表達(dá)。

　　生物學(xué)論文投稿刊物：《基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)》主要刊登現(xiàn)代生物技術(shù)的前沿學(xué)科和基礎(chǔ)學(xué)科如基因組學(xué)、分子細(xì)胞遺傳學(xué)、生化與分子生物學(xué)、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和應(yīng)用生物學(xué)等相關(guān)的原始研究成果。刊登人類、動物、微生物及植物領(lǐng)域在組織、器官、細(xì)胞、染色體、蛋白質(zhì)、基因、酶和發(fā)酵工程等不同水平上的現(xiàn)代生物技術(shù)等基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究成果。

　　在青鳉魚中，mitf基因在胚胎整個發(fā)育過程中最早表達(dá)于2細(xì)胞期，這與橘色雙冠麗魚表達(dá)模式相類似(Lietal,2013)。蔣燕玲等(2016)對橘色雙冠麗魚胚胎組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，黑色素細(xì)胞在血液循環(huán)期才開始出現(xiàn)，而mitf在受精卵時期即出現(xiàn)高表達(dá)現(xiàn)象，結(jié)合前人報道，推測魚類發(fā)育早期mitf不僅調(diào)節(jié)黑色素細(xì)胞分化和發(fā)育，對視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、破骨細(xì)胞和肥大細(xì)胞中也有不同程度的調(diào)控作用(Baueretal,2009)。在卵裂期，mitf1、mitf2基因表達(dá)量驟減，mitf1隨胚胎發(fā)育表達(dá)量繼續(xù)降低直至聽泡期驟升后又繼續(xù)下降，而mitf2隨胚胎發(fā)育表達(dá)量逐漸升高直至血液循環(huán)期，仍呈現(xiàn)上升趨勢，預(yù)示mitf基因可能在黑色素細(xì)胞的發(fā)育過程中扮演著十分重要的角色。

　　參考文獻(xiàn)

　　AltschmiedJ,DelfgaauwJ,WildeB,etal.Subfunctionalizationofduplicatemitfgenesassociatedwithdifferentialdegenerationofalternativeexonsinfish.Genetics,2002,161(1):259–267

　　BarluengaM,MeyerA.Phylogeography,colonizationand populationhistoryoftheMidascichlidspeciescomplex(Amphilophusspp.)intheNicaraguancraterlakes.BMCEvolutionaryBiology,2010,10(1):326–326Bauer

　　GL,PraetoriusC,BergsteinsdottirK,etal.TheroleofMITFphosphorylationsitesduringcoatcolorandeyedevelopmentinmiceanalyzedbybacterialartificialchromosometransgenerescue.Genetics,2009,183(2):581–594

　　BentleyNJ,EisenT,GodingCR.Melanocyte-specificexpressionofthehumantyrosinasepromoter:Activationbythemicrophthalmiageneproductandroleoftheinitiator.MolecularandCellularBiology,1994,14(12):7996–8006

　　CohenMA,WertKJ,GoldmannJ,etal.Humanneuralcrestcellscontributetocoatpigmentationininterspecieschimerasafterinuteroinjectionintomouseembryos.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2016,113(6):1570–1575

　　HauswirthR,HaaseB,BlatterM,etal.MutationsinMITFandPAX3cause“splashedwhite”andotherwhitespottingphenotypesinhorses.PLoSGenetics,2019,15(8):e1002653

　　HemesathTJ,SteingrimssonE,McGillG,etal.Microphthalmia,acriticalfactorinmelanocytedevelopment,definesadiscretetranscriptionfactorfamily.GenesandDevelopment,1994,8(22):2770–2780

　　作者：陳旭東1,2鄔國強1,2宋紅梅2①汪學(xué)杰2牟希東2劉奕2劉超2胡隱昌2