摘要:20世紀(jì)初“遺傳的染色體學(xué)說(shuō)”的提出和證明標(biāo)志著細(xì)胞遺傳學(xué)交叉學(xué)科建立，伴隨相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，20世紀(jì)60年代末期細(xì)胞遺傳學(xué)又與分子遺傳學(xué)相結(jié)合，建立發(fā)展了分子細(xì)胞遺傳學(xué)交叉學(xué)科。分子細(xì)胞遺傳學(xué)以DNA分子原位雜交技術(shù)為核心，不斷拓展應(yīng)用領(lǐng)域，為生命科學(xué)研究提供了直觀、高效的技術(shù)手段。原位雜交技術(shù)與基因組、細(xì)胞生物學(xué)等技術(shù)結(jié)合，被廣泛應(yīng)用于人類、動(dòng)物、植物的起源、進(jìn)化、馴化等基礎(chǔ)研究和遠(yuǎn)緣雜交、染色體工程等應(yīng)用研究。通過(guò)形象地展示DNA、RNA、蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的實(shí)際位置，揭示DNA序列之間的實(shí)際位置和順序、親緣物種間的進(jìn)化關(guān)系和結(jié)構(gòu)重排、基因組拼接序列的質(zhì)量、轉(zhuǎn)錄水平RNA和翻譯水平蛋白質(zhì)的位置和數(shù)量變化等。江蘇省遺傳學(xué)會(huì)會(huì)員單位南京農(nóng)業(yè)大學(xué)、揚(yáng)州大學(xué)、南京林業(yè)大學(xué)、江蘇師范大學(xué)、徐淮地區(qū)農(nóng)科院等自20世紀(jì)中期開展細(xì)胞遺傳學(xué)理論技術(shù)研究，伴隨學(xué)科發(fā)展不斷創(chuàng)新，建立了較完善的分子細(xì)胞遺傳技術(shù)體系，并成功應(yīng)用于開展植物系統(tǒng)進(jìn)化、遠(yuǎn)緣雜交、染色體工程、基因組學(xué)等研究，取得了一批研究成果。本文將主要綜述江蘇省在該領(lǐng)域取得的重要進(jìn)展，并展望未來(lái)發(fā)展方向。

　　關(guān)鍵詞:江蘇省遺傳學(xué)會(huì);分子細(xì)胞遺傳學(xué);DNA分子原位雜交;染色體工程;基因組學(xué)

　　20世紀(jì)初期，美國(guó)遺傳學(xué)家Sutton和德國(guó)生物學(xué)家Boveri提出“遺傳的染色體學(xué)說(shuō)”，該學(xué)說(shuō)的證明標(biāo)志著細(xì)胞遺傳學(xué)的誕生和成熟。以美國(guó)康奈爾大學(xué)為核心的科學(xué)家利用玉米作為研究對(duì)象，闡明了植物性狀遺傳變異的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，建立和完善了植物細(xì)胞遺傳的理論和技術(shù)體系。日本的Kihara教授和美國(guó)的Sears教授以異源六倍體小麥(TriticumaesticumL.)及其祖先種為研究對(duì)象，建立了麥類植物細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，并將其應(yīng)用于異源多倍體小麥的基因組分析、非整倍體創(chuàng)制和鑒定、小麥遠(yuǎn)緣雜交等研究，闡明了小麥3個(gè)亞基因組的起源、麥類植物不同亞基因組染色體間的部分同源關(guān)系。此后，研究者們?cè)诤芏嘀参镂锓N中開展了細(xì)胞遺傳研究，建立了染色體核型分析、染色體構(gòu)型分析和染色體分帶等經(jīng)典細(xì)胞遺傳學(xué)核心技術(shù)，為物種的起源、系統(tǒng)分類、以及植物遺傳改良等提供了基礎(chǔ)的細(xì)胞學(xué)信息。

　　伴隨遺傳物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)、DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解析、探針標(biāo)記技術(shù)和顯微技術(shù)等不斷取得突破，分子遺傳學(xué)理論和技術(shù)快速發(fā)展，并向細(xì)胞遺傳學(xué)不斷滲透，20世紀(jì)60年代末期美國(guó)耶魯大學(xué)Gall等科學(xué)家在動(dòng)物中建立的DNA分子原位雜交(insituhybridization,ISH)技術(shù)，成為分子細(xì)胞遺傳學(xué)這一分支學(xué)科建立的里程碑。該技術(shù)很快被用于植物細(xì)胞遺傳學(xué)研究，并得到快速發(fā)展和廣泛應(yīng)用，為植物遺傳育種、基因組學(xué)和分子生物學(xué)研究提供了直觀有效的研究手段。ISH伴隨相關(guān)學(xué)科的發(fā)展不斷發(fā)展，雜交利用的探針分子可以是DNA、RNA和蛋白抗體;DNA探針包括基因組DNA、重復(fù)序列DNA、BAC等人工染色體克隆、單拷貝基因DNA、寡核苷酸探針庫(kù)等。

　　探針標(biāo)記物包括放射性分子、半抗原、熒光素等;雜交的對(duì)象包括有絲分裂中期染色體、減數(shù)分裂粗線期或中期I染色體、間期核DNA纖維。由此建立了genomicinsituhybridization(GISH)、multi-colorfluorescenceinsituhybridization(FISH)、BAC-FISH、fibre-FISH、oligo-FISH、oligo-painting、immuno-staining、seqFISH、rmFISH等新技術(shù)，通過(guò)形象地展示DNA、RNA、蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的實(shí)際位置，揭示DNA序列之間的實(shí)際位置和順序、親緣物種間的進(jìn)化關(guān)系和結(jié)構(gòu)重排、基因組拼接序列的質(zhì)量、轉(zhuǎn)錄水平RNA和翻譯水平蛋白質(zhì)的位置和數(shù)量變化等。

　　江蘇省植物細(xì)胞遺傳學(xué)研究起步較早，覆蓋面廣，應(yīng)用成效顯著。圍繞水稻(Oryzasativa)、小麥(Triticumaestivum、棉花(Gossypzumhirsutum)等主要作物以及瓜屬(Cucumis)、甘薯(Ipomoeabatatas)、菊屬(Chrysanthemum)、楊屬(Populus)園藝和林木植物，建立了完善的細(xì)胞學(xué)和分子細(xì)胞遺傳學(xué)研究體系，成功應(yīng)用于遺傳改良、基因組解析和比較基因組、物種起源進(jìn)化、染色體生物學(xué)等研究領(lǐng)域，取得了多項(xiàng)基礎(chǔ)和應(yīng)用研究成果。在江蘇遺傳40周年之際，本文將回顧江蘇省遺傳學(xué)會(huì)會(huì)員單位圍繞主要糧食作物、園藝作物、林木等物種，在植物分子細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域的重要研究進(jìn)展，并展望該研究領(lǐng)域未來(lái)的發(fā)展方向。

　　1普通小麥(2n=6x=42，基因組AABBDD)是異源六倍體。小麥及其近緣物種染色體大，容易觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)，因此成為早期植物細(xì)胞遺傳學(xué)研究的優(yōu)良材料。Kihara教授建立基于遠(yuǎn)緣雜交和細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)的染色體組分析理論，闡明了栽培小麥A、B和D3個(gè)亞基因組以及其他小麥族物種的二倍體、四倍體祖先供體。Sears教授是小麥細(xì)胞遺傳學(xué)和染色體工程的先驅(qū)，20世紀(jì)30年代開始?xì)v時(shí)40余年，先后培育出小麥單體、三體和缺體-四體及端體等非整倍體系列，將小麥3個(gè)染色體組的染色體根據(jù)其補(bǔ)償關(guān)系劃歸到7個(gè)部分同源群。

　　Gill教授實(shí)驗(yàn)室建立了可識(shí)別全部21對(duì)小麥染色體的分帶技術(shù)(1991)[1];Rayburn和Gill[2~4]最早利用生物素標(biāo)記的重復(fù)序列探針進(jìn)行ISH，識(shí)別小麥染色體;Mukai等[5]建立基于重復(fù)序列的雙色I(xiàn)SH技術(shù)，可識(shí)別17對(duì)小麥染色體;Zhang等[6]建立以烏拉爾圖小麥A組和粗山羊草D組為探針、擬斯卑爾脫山羊草S組為封阻的GISH技術(shù)，可以區(qū)分普通小麥A、B、D3個(gè)亞基因組。

　　近年來(lái)，基因組測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展不僅為分子生物學(xué)研究提供了豐富的信息，同時(shí)也加快了植物分子細(xì)胞遺傳學(xué)的研究，尤其是用于小麥FISH的探針不斷發(fā)展，出現(xiàn)了寡核苷酸FISH、單拷貝基因FISH和基于單拷貝基因的寡核苷酸探針庫(kù)。此外，在小麥中還建立了基于流式細(xì)胞儀的染色體分揀、基于顯微切割的特定染色體區(qū)段切割分離等分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，用于結(jié)構(gòu)和功能基因組研究[7~10]。建立的黑麥、大麥等的分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)體系，為小麥與近緣物種的遠(yuǎn)緣雜交、染色體工程和比較基因組研究提供了有效的技術(shù)手段。下面簡(jiǎn)要介紹南京農(nóng)業(yè)大學(xué)在小麥分子細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域的研究進(jìn)展。

　　1.1小麥及近緣物種染色體鑒定技術(shù)

　　染色體身份和染色體結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確快速鑒定是開展染色體工程、基因組分析等研究的重要基礎(chǔ)。早在20世紀(jì)80年代初期，江蘇省遺傳學(xué)會(huì)學(xué)會(huì)前理事長(zhǎng)、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞遺傳研究所劉大鈞院士帶領(lǐng)團(tuán)隊(duì)，與Gill教授合作，開展小麥及其近緣物種染色體鑒定技術(shù)研究。先后在六倍體普通小麥、四倍體硬粒小麥、簇毛麥、大賴草、鵝觀草屬等物種中建立了染色體分帶技術(shù)[11~18];染色體分帶與染色體配對(duì)的構(gòu)型分析結(jié)合，糾正了小麥4A和4B的身份[11]，初步分析我國(guó)特有半野生小麥的染色體組成，用于鑒定創(chuàng)制的硬粒小麥-簇毛麥雙二倍體等遠(yuǎn)緣種質(zhì)[19,20]。20世紀(jì)90年代開始分子遺傳學(xué)研究。

　　建立了以生物素標(biāo)記基因組DNA為探針的體細(xì)胞和花粉母細(xì)胞染色體GISH技術(shù)，明確了小麥-簇毛麥易位系中小麥和外源染色體的組成[21];從外源物種中克隆基因組特異重復(fù)序列,利用在簇毛麥中克隆的特異重復(fù)序列進(jìn)行ISH，特異識(shí)別小麥背景中的簇毛麥染色體[22];建立了基于熒光素標(biāo)記探針的GISH技術(shù)，用于鑒定導(dǎo)入小麥背景中的鵝觀草屬、賴草屬、黑麥、偃麥草等物種的染色體或染色體區(qū)段[23~30]，實(shí)驗(yàn)室研究全面進(jìn)入分子細(xì)胞遺傳學(xué)階段。重復(fù)序列探針的開發(fā)和熒光素標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，為基于重復(fù)序列和雙色/多色FISH的核型分析提供了更快速精確的技術(shù)手段。

　　Zhang等[6]利用pSc119.2等4個(gè)質(zhì)粒探針構(gòu)建了簇毛麥品系91C43的FISH核型，并用于鑒定小麥-簇毛麥異附加系、代換系和易位系中外源染色體的具體身份;為提高FISH效率，Du等[31]開發(fā)了基于重復(fù)序列的寡核苷酸探針庫(kù)，并用于鑒定小麥品種、黑麥、偃麥草等染色體結(jié)構(gòu)變異;王艷芝[32]開發(fā)了一批寡核苷酸探針用于替代原先的質(zhì)粒探針，通過(guò)ND-FISH或FISH鑒定小麥染色體組成;進(jìn)一步優(yōu)化小麥、百薩偃麥草、黑麥等寡核苷酸探針套，建立栽培一粒小麥、硬粒小麥、荊州黑麥、長(zhǎng)穗偃麥草等物種的標(biāo)準(zhǔn)核型，可快速鑒定小麥背景中的外源染色體，并構(gòu)建建國(guó)以來(lái)我國(guó)373個(gè)大面積栽培品種及骨干親本高清核型，揭示其中存在的自發(fā)結(jié)構(gòu)變異[31,33~35]。Guo等[36]利用寡核苷酸探針FISH分析了異花授粉黑麥品種染色體演化特征，并細(xì)胞學(xué)定位荊州黑麥毛頸基因區(qū)段。

　　Sun等[37]利用基于簇毛麥基因組序列新開發(fā)的寡核苷酸探針，結(jié)合利用4個(gè)已報(bào)道寡核苷酸探針，構(gòu)建了簇毛麥不同品系的FISH核型，揭示了不同品系間的核型多態(tài)性。為解析外源染色體基因組序列，開發(fā)更多近緣物種特異重復(fù)序列探針和特異分子標(biāo)記，克隆外源優(yōu)異基因，與捷克Dolezel教授實(shí)驗(yàn)室合作，利用流式細(xì)胞儀分揀了簇毛麥6VS和4VS染色體，Xiao等[38]在解析4VS序列基礎(chǔ)上，通過(guò)生物信息學(xué)鑒定出兩條反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子重復(fù)序列，經(jīng)FISH分析發(fā)現(xiàn)均特異彌散分布于簇毛麥所有染色體上，雜交信號(hào)與GISH信號(hào)相似;Lei等[39]利用6VS染色體分揀測(cè)序獲得的基因組序列信息，開發(fā)了基于重復(fù)序列的7個(gè)寡聚核苷酸探針，將其中兩個(gè)探針相結(jié)合，進(jìn)一步豐富了簇毛麥的FISH核型。

　　2水稻(2n=2x=24)是重要的糧食作物，基因組大小389Mb[67]，是禾本科作物中基因組最小的作物。水稻是最早完成基因組測(cè)序的作物，因此也成為作物學(xué)研究的模式物種。基因組大小與細(xì)胞核內(nèi)的染色體大小一般呈正相關(guān)的關(guān)系，水稻染色體在禾本科作物中也屬于最小的類型之一，因此水稻細(xì)胞遺傳學(xué)相較于玉米、小麥起步較晚。

　　2.1水稻染色體鑒定技術(shù)由于水稻有絲分裂前中期染色體很小，不同染色體的大小十分接近，因此僅僅依靠形態(tài)特征很難完全準(zhǔn)確辨別出水稻體細(xì)胞中的所有染色體。因此，在20世紀(jì)90年代以前，有關(guān)水稻核型中的染色體相對(duì)長(zhǎng)度、臂比、核仁染色體等數(shù)據(jù)，不同研究者的結(jié)果不盡相同。后來(lái)研究者建立了基于減數(shù)分裂粗線期染色體的細(xì)胞學(xué)分析技術(shù)[68]，解決了體細(xì)胞染色體過(guò)短的問(wèn)題。但傳統(tǒng)的粗線期染色體制片技術(shù)難度較大，需要發(fā)展更簡(jiǎn)單有效的方法準(zhǔn)確識(shí)別不同染色體，推進(jìn)水稻的細(xì)胞遺傳學(xué)研究。

　　3甜瓜屬是葫蘆科重要的屬，包含52個(gè)物種，其中包括兩個(gè)重要的經(jīng)濟(jì)作物，即從大約100億年以前的一個(gè)相同祖先分化而來(lái)的黃瓜(CucumissativusL.,2n=14,367Mb)和甜瓜(C.meloL.,2n=24,450Mb)[90]。甜瓜屬物種染色體相對(duì)較小，細(xì)胞遺傳研究起步較晚。甜瓜屬包括許多重要的野生種，具有栽培黃瓜和甜瓜所需的多種優(yōu)良性狀，開展細(xì)胞遺傳研究，闡明物種間的進(jìn)化關(guān)系，對(duì)于挖掘和利用野生種的優(yōu)良性狀基因，推進(jìn)甜瓜屬作物品種改良具有重要意義。

　　3.1甜瓜屬染色體鑒定技術(shù)甜瓜屬中黃瓜細(xì)胞遺傳學(xué)研究相對(duì)較多。黃瓜中期染色體較小，傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)技術(shù)難以準(zhǔn)確描述和識(shí)別黃瓜染色體，染色體分帶技術(shù)在黃瓜染色體鑒定中起到了不可替代的作用，其中以C帶在黃瓜中應(yīng)用最為廣泛。Chen等[91]利用改良的染色體制片技術(shù)和C帶技術(shù)建立了黃瓜的有絲分裂中期染色體核型，但黃瓜中期染色體較短，C帶分辨率不高，難以準(zhǔn)確識(shí)別黃瓜每條染色體。錢春桃等[92]采用放線菌酮預(yù)處理活體種子根改進(jìn)制片技術(shù)，獲得了清晰的黃瓜前中期染色體C帶帶型。

　　4棉花(Gossypzumhirsutum,2n=4x=AADD=52)是重要的纖維作物，也是重要的植物油脂和植物蛋白質(zhì)來(lái)源。目前世界上廣為栽培的棉花為異源四倍體種，為紡織工業(yè)提供了90%以上的棉纖維。棉屬有52個(gè)種，包括45個(gè)二倍體種，根據(jù)親緣關(guān)系分成A-G和K等8個(gè)基因組(其中2個(gè)為A組栽培種)以及7個(gè)由AD基因組組成的異源四倍體種(含2個(gè)為栽培種)，是改良栽培棉花的重要基因資源，通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交轉(zhuǎn)移和利用外源基因?qū)τ诿藁ǜ牧加兄匾�意義。

　　4.1棉花染色體鑒定技術(shù)

　　棉花染色體數(shù)量多，形態(tài)相似且較短小，未建立染色體分帶等核型分析技術(shù)，因而難以準(zhǔn)確識(shí)別特定染色體。GISH技術(shù)提供了有效鑒定手段。以野生種斯特提棉(G.sturtianumWillis)為探針，在陸地棉(G.hirsutumL)標(biāo)準(zhǔn)系TM-1體細(xì)胞有絲分裂中期染色體上進(jìn)行GISH，可以鑒定出栽培棉中的外源染色體[111]。以A1基因組的阿非利加草棉(G.herbaceumLvar.africanum)和C1基因組的斯特提棉兩個(gè)棉種的DNA同時(shí)為探針進(jìn)行GISH，可以清晰地區(qū)分At、Dt和C1基因組染色體，且重復(fù)性好，這一棉花多色GISH技術(shù)體系成功應(yīng)用于種間雜種的鑒定[111]。對(duì)引自澳大利亞CSIRO的陸地棉與澳洲棉(G.australeF.v.M.)(G2基因組)六倍體雜種(基因組組成為AtAtDtDtG2G2)進(jìn)行的多色GISH，可清晰地區(qū)分At、Dt和G2基因組染色體[111]。

　　Wang等[112~114]開發(fā)了基于棉花連鎖群(染色體)的特異BAC克隆，獲得第一套多倍體植物四倍體棉染色體特異的BAC克隆，利用BAC-FISH雜交信號(hào)可作為染色體特異的細(xì)胞學(xué)標(biāo)記，準(zhǔn)確地識(shí)別出棉花26條染色體。Wang等[114]利用棉花高密度遺傳圖譜的SSR分子標(biāo)記篩選出了20個(gè)BAC克隆，與45S和5SrDNA相結(jié)合，構(gòu)成了由22個(gè)探針混合形成的雞尾酒式文庫(kù)，以亞洲棉江陵中棉有絲分裂中期染色體為靶標(biāo)，一次FISH產(chǎn)生的信號(hào)可以同時(shí)識(shí)別亞洲棉的13對(duì)染色體，且與陸地棉A染色體亞組的部分同源染色體一一對(duì)應(yīng)，獲得了亞洲棉穩(wěn)定可靠的標(biāo)準(zhǔn)核型，實(shí)現(xiàn)了亞洲棉染色體的準(zhǔn)確識(shí)別。

　　植物方向論文范例：植物精油對(duì)提高葡萄抗寒性的影響研究

　　5菊科(Compositae)春黃菊族(Anthemideae)菊屬(Chrysanthemum)的菊屬約有43個(gè)種和18個(gè)變種(亞種)，它們以染色體基數(shù)9形成一個(gè)從二倍體到十倍體的多倍體系列。其中菊花(C.morifoliumRamat.)為多年生草本植物，是我國(guó)十大傳統(tǒng)名花和世界四大切花之一，觀賞和經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高。栽培菊花大多為六倍體及非整倍體，具有高度雜合、自交不親和及近交衰退等特性。我國(guó)是栽培菊花的起源中心，但原有商業(yè)主栽品種多為國(guó)外引進(jìn)，抗蚜蟲性、耐低/高溫性差和種性退化等成為限制我國(guó)菊花產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。開展菊花分子細(xì)胞遺傳學(xué)研究對(duì)于探究菊花起源與演化、菊屬種間親緣關(guān)系以及利用遠(yuǎn)緣雜交拓寬菊花遺傳基礎(chǔ)具有重大意義。

　　作者：王海燕1，龔志云2，蔣甲福1，周寶良1，婁群峰1，曹清河3，席夢(mèng)利4，陳佩度1，顧銘洪2，張?zhí)煺?，陳發(fā)棣1，陳勁楓1，李宗蕓5，王秀娥1*