摘要：探討牛至油對慢性氨氮脅迫下幼鯉各器官組織結構的保護作用，為集約化水產養殖條件下確定牛至油合適的添加量提供參考依據。挑選450尾初始體重為(17.020.4)的幼鯉，隨機分為組：(對照組，養于正常水體中并飼喂基礎飼料);L0、L300、L600、L900、L1200(試驗組，養于，4.80.2mg/L氨氮水體中并分別飼喂添加、300、600、00、200mg/kg牛至油的試驗飼料)，每組設個重復，每個重復尾魚，養殖試驗為期56。結果表明：添加量為900mg/kg時，牛至油對鰓、肝、腎組織發揮的緩解作用最大;當牛至油添加量達到1200mg/kg時，其緩解氨氮脅迫的作用降低。日糧中牛至油添加量為300、600、900mg/kg可以顯著增加腸絨毛高度;當牛至油添加量達到1200mg/kg時，牛至油對于腸絨毛的促生長作用減弱。在試驗條件下，日糧中添加900mg/kg的牛至油能夠最大程度地緩解由氨氮脅迫造成的幼鯉鰓、肝和腎組織的損傷，并且對于幼鯉腸絨毛的生長具有促進作用。

　　關鍵詞：牛至油;慢性氨氮脅迫;幼鯉;組織結構

　　氨氮是魚類的主要環境脅迫因子，也是水質監測的重要指標。氨氮在水體中的主要存在形式為離子氨和非離子氨(又稱為游離態氨)，二者所占比例與溫度、值和溶氧等因素密切相關：水體值越高，水中非離子氨所占比例越大，水溫升高或溶氧降低也會使非離子氨含量略有增加，當值達到時，氨氮幾乎全以非離子氨的形式存在(王琨，2007)。因非離子氨是不帶電荷、半徑較小的親脂性分子，極易通過鰓等途徑進入魚體，其毒性遠遠大于離子氨(Haywood，1983)。隨著水產養殖規模的不斷擴大，養殖密度過高、飼養方式粗放、不重視水質監測等問題，使得殘餌、排泄物大量堆積在水體中并降解為氨氮，導致養殖水體氨氮濃度過高。

　　相關研究指出，魚類長期生活在非離子氨濃度大于0.1mg/L的水體時，即可造成魚類慢性氨氮中毒(喬順風等，2005)。非離子氨不僅會使魚類的生長以及新陳代謝出現問題，還會損傷魚體的重要組織器官(管敏等，2020)，如鰓小片萎縮，變粗、變短;肝細胞出現核偏移、空泡化;腎小管、腎小球萎縮、壞死等，甚至造成其死亡。牛至(OriganumvulgareL.)屬于唇形科多年生草本植物，其提取物——牛至油可用作飼料添加劑。

　　牛至油的主要成分是香芹酚和百里香酚(Sabahietal2020)，具有抗菌、殺菌等作用。在飼料中添加牛至油，不但能改善飼料的品質，提高動物的生長性能，而且能夠增強動物的免疫功能，預防疾病等。在牛至油替代抗生素和氧化鋅對斷奶仔豬的影響的研究中(溫曉鹿等，2020)，發現牛至油的促生長作用略高于抗生素和氧化鋅，且同樣能夠抑制有害菌對腸道的損傷。

　　郝丹丹等(2017)研究發現，在成年蛋雞飼料中添加牛至油能夠提高蛋雞生長性能、增強免疫機能以及加強腸道健康。韓慶功等(2016)在牛至油對仔豬生產性能、抗體水平及糞便微生物的影響試驗中也有相似的結果。目前關于牛至油應用在氨氮脅迫下水產動物養殖上的研究還比較少。因此，本試驗通過飼料中牛至油的添加，探討牛至油對慢性氨氮脅迫下幼鯉各器官組織結構的保護作用，為集約化水產養殖條件下確定牛至油合適的添加量提供參考依據。

　　1材料與方法

　　1.1試驗飼料基礎飼料組成及其營養水平(風干基礎)見表。主要蛋白源為秘魯魚粉(粗蛋白質含量67.00%)、豆粕(粗蛋白質含量44.20%);主要脂肪源為大豆油。在基礎飼料中分別添加、300、600、900、1200mg/kg的牛至油，以制備試驗飼料。每種飼料原料粉碎后過目篩，按照基礎飼料配方精確稱量、采用逐級擴大法混勻，制成顆粒飼料，在℃烘干后置于20℃保存備用(郝丹丹等，2017)。牛至油預混料劑(諾必達)(其有效成分為香芹酚百里香酚40:1)購自匯海華貿(上海)實業有限公司(批號：428245)。

　　1.2試驗動物及分組試驗所用魚苗購自重慶市榮昌區(105.°E，29.4°N)小羅漁場。購買的魚苗經3%NaCl溶液消毒，在西南大學水產學院校內養殖基地的水泥池暫養后，挑選大小接近、健康無病，初始體重為(17.020.40)的幼鯉450尾，隨機分為六組：(對照組，養于正常水體中并飼喂基礎飼料)，L0、L300、L600、L900、L1200(試驗組，飼養于氨氮濃度為4.870.21mg/L的水體中)(確定依據見1.3飼養管理)，飼喂牛至油添加量分別為、300、600、00、200mg/kg的試驗飼料)，每組設個重復，每個重復25尾魚，分別養殖于水族缸中。

　　1.3飼養管理

　　氨氮濃度的確定：根據研究報導鯉96非離子氨半致死濃度(LC50)為0.6mg/L(韓慶功等，2016)，基于鯉96hLC50的安全濃度應為.06mg/L，確定本試驗非離子氨濃度為0.1mg/L，依照非離子氨和總氨氮濃度的換算公式，設置總氨氮濃度為4.8mg/L，實測值為(.870.21)mg/L。

　　1.4樣品采集及分析養殖試驗結束，禁食24后，對每個養殖缸的幼鯉進行計數和稱重。每缸隨機挑選尾幼鯉，使用麻醉劑MS222麻醉后在冰盤上取材，采集魚體右側第二鰓弓處鰓絲，解剖實驗魚，取出其腎臟、肝胰臟、腸道組織，經.65NaCl溶液漂洗后，用4%多聚甲醛固定，用于制作石蠟切片。

　　2結果

　　2.1牛至油對慢性氨氮脅迫下幼鯉生長的影響

　　養殖試驗進行了56，各組試驗魚未見死亡情況，成活率均為100.00%。飼料中添加不同含量的牛至油在慢性氨氮脅迫下對幼鯉生長性能的影響見表。在慢性氨氮脅迫下，未添加牛至油的L0組幼鯉的終末體重、增重率和特定生長率均顯著低于無氨氮脅迫的對照組(<0.05l600l300l600l900>0.05)，但均顯著高于L0組(<0.05)，L600組的增重率顯著高于L1200組(<0.05l300l600l900>0.05)。

　　2.牛至油對慢性氨氮脅迫下幼鯉鰓組織的影響

　　牛至油對氨氮脅迫下幼鯉鰓、肝、腎和腸道組織顯微結構的影響，氨氮脅迫下的L0組幼鯉鰓小片長度顯著小于無氨氮脅迫的對照組(<0.05)，鰓小片寬度則相反(<0.05)。在氨氮脅迫的各組中，當牛至油添加量從增加00mg/kg時，鰓小片長度呈增加趨勢，鰓小片寬度呈降低趨勢;L300、L600和L900的鰓小片長度顯著高于L0組(<0.05)，低于組(<0.05)，這組之間差異不顯著(0.05)，其中以L900鰓小片長度最長，(150.0813.37)μm;L300、L600和L900的鰓小片寬度顯著低于L0組(<0.05)，除L900組外，均顯著高于組;300和600之間鰓小片寬度差異不顯著(0.05)。當牛至油添加量繼續增加到200mg/kg時，鰓小片長度顯著降低(<0.05)，鰓小片寬度顯著增大(<0.05)。從以上結果來看，L900的鰓小片長度和鰓小片寬度最接近于無氨氮脅迫的對照組。

　　3討論

　　3.1氨氮脅迫對幼鯉鰓、肝、腎和腸道的影響

　　水體氨氮的增高會對魚類產生急性毒性和慢性毒性效應。急性效應表現為鰓過度通氣、機體亢奮、游泳不穩定、失去平衡、反應遲緩、抽搐或死亡，體色變化，免疫防御功能受到抑制，病原敏感性增加等(Ipetal,2001;Silvaetal2018;孟振等，2020;盧霞等，2018)。

　　在白斑狗魚(Esoxlucius)、擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)和團頭魴(Megalobramaamblycephal)的急性氨氮脅迫試驗中發現，動物的死亡率與氨氮濃度、持續時間相關(彭軍輝等;2018;張武肖等，2015)。而慢性毒性效應則表現為攝食降低、生長減慢、免疫力降低等(Pengetal,2017)。本試驗對幼鯉進行慢性氨氮脅迫毒性試驗時，幼鯉成活率為100.00%，而終末體重、增重率和特定生長率都顯著低于正常養殖條件，與上述試驗結果相似。愈來愈多的研究者認為，魚類氨中毒致死可能與機體氧化損傷和免疫抑制有關。

　　魚類處于氨氮脅迫中，機體內源性氨的排泄被阻斷，外源性氨經鰓和皮膚進入體內，產生大量氧自由基。當魚類的抗氧化酶體系不能完全清除這些自由基時，自由基的過度積累會破壞組織結構，加劇膜脂質過氧化程度及醛酮類物質積累，醛酮類又使抗氧化酶活性失活，進一步加重組織損傷。隨著外源性氨逐漸釋放到血液中，影響淋巴細胞和巨噬細胞的含量和活性，使得免疫反應受到抑制(林小能，2013)，各個組織器官更易遭受自由基的攻擊而損傷。鰓不僅是魚類重要的呼吸器官還具有調節滲透壓、過濾食物、排泄氨氮等功能。

　　鰓直接暴露于外部環境，參與水環境與魚體之間的物質交換，因此鰓組織最易受到不良環境的影響。在團頭魴、圓斑星鰈(Veraspervariegatus)、淇河鯽(Carassiusauratus)、泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)和虎斑烏賊(Sepiapharaonis)的急性氨氮脅迫試驗表明，隨脅迫時間的延長和氨氮濃度的增加，鰓組織出現不同程度的損傷，表現為鰓絲毛細血管擴張、水腫，表面分泌物增多，鰓小片卷曲、融合、變短，上皮組織增生，上皮細胞核溶解，細胞空泡化，呼吸上皮細胞排列紊亂、水腫變性、壞死、脫落，柱狀細胞排列不整齊等(張武肖等，2015;吳利敏等，2020;郝小鳳等，2012;陳思涵等，2018)。這些與本試驗研究結果情況相似。本試驗中，慢性氨氮脅迫導致幼鯉鰓組織增生，鰓小片變粗、變短，扁平上皮細胞排列混亂、脫落。

　　王夢杰等(2021)亦報道慢性氨氮脅迫后，臺灣泥鰍隨氨氮濃度的升高出現不同程度的鰓組織損傷，表現為鰓小片短小、上皮細胞水腫、細胞空泡化、上皮細胞壞死和脫落。這主要是由于水體中的非離子氨為親脂性分子，半徑較小，容易穿透脂質性生物膜的疏水性微孔進入生物體內，從而損害鰓組織，導致機體出現缺氧、酸堿平衡失調、滲透壓平衡被破壞以及氨代謝受阻等一系列生理損傷，進而導致其免疫能力受到損害，乃至死亡(吳利敏等，2020;Dutraetal，2017)。

　　肝臟是機體主要的代謝和解毒器官，氨氮經血液運輸到肝臟后，肝臟利用其豐富的酶降低氨氮毒性。高濃度的非離子氨作用于肝臟，導致肝功能障礙，體內抗氧化、抗應激能力下降，過氧化物在肝臟中累積，進一步加重毒性反應。在虎斑烏賊、圓斑星鰈、團頭魴、中華條頸龜(M.sinensis)、線紋海馬Hippocampuserectus的急性氨氮脅迫試驗中，肝臟出現肝小葉輪廓模糊不完整、排列不緊密，肝血竇擴張、縮小、充血、消失;肝細胞腫脹、輪廓模糊，胞漿疏松透明，變性、空泡化、溶解，肝細胞核出現腫大、偏移、溶解、消失等現象(陳思涵等，2018;張武肖等，2015;黃祖彬等，2021;羅輝玉等，2020)。

　　本試驗中，慢性氨氮脅迫導致幼鯉肝細胞輪廓模糊不清，肝血竇中紅細胞核濃縮度低，導致載氧能力下降。管敏等(2019)亦證實慢性氨氮脅迫能降低子二代中華鱘(Acipensersinensis)肝臟超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、總抗氧化能力(TAOC)、谷胱甘肽GSH)含量、溶菌酶LZM)活性及免疫球蛋白IgM)，使機體抗氧化能力和免疫能力減弱。除此之外，本試驗亦監測到各氨氮脅迫組的肝細胞直徑顯著小于生活在正常水體中的幼鯉的肝細胞直徑，這可能是由于氨氮脅迫影響肝功能，從而造成肝細胞變小。

　　中華鱘、史氏鱘(Acipenserschrencki)幼魚肝體比隨著水體氨氮濃度的升高呈逐漸降低趨勢，亦證實了這一點(管敏等，2019;2020)。然而，黎慶等(2015)報道慢性氨氮脅迫組黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)幼魚的肝體比顯著高于對照組，認為是醛酮類物質過度積累誘發了肝臟器官組織水腫。肝臟對氨氮脅迫表現出來的不同反應可能與魚種、氨氮濃度及氨氮脅迫時間等因素有關，需要進一步研究分析。腎臟作為魚類的主要排泄器官，在清除機體代謝廢物，調節水鹽平衡、滲透壓平衡等過程中發揮重要的作用。水體中過多的有害物質會對魚類腎臟的組織結構及其生理功能產生較大的危害。

　　張武肖等(2015)和吳利敏等(2020)研究表明，急性氨氮脅迫對團頭魴(Megalobramaamblycephala)、淇河鯽腎臟的危害主要表現為腎小管管腔縮小、腎小球萎縮，腎小囊腔膨大、淋巴細胞浸潤等，且隨著時間的延長和濃度的增加出現腎小管壞死、腎小球壞死的現象。急性氨氮脅迫使得中華條頸龜腎臟腎小管管腔縮小，上皮細胞發生顆粒變性，部分細胞從基膜脫落，細胞膜破裂，腎小球體積增大、毛細血管網擴張，細胞核固縮甚至溶解消失，間質炎性細胞浸潤等(黃祖彬等，2021)。

　　本試驗中，慢性氨氮脅迫下的組幼鯉腎小管管腔縮小，有的甚至壞死，腎小球萎縮，腎小囊腔寬度增加，與上述試驗結果相似。這與機體抗氧化能力和免疫力的降低不無關系。姜會民(2012)研究發現高濃度氨氮脅迫使得黃河鯉魚(Cyprinuscarpio)腎臟超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSHPx)活性下降和丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量增加，反應了氨氮脅迫對腎臟造成了損傷，使得其抗氧化能力下降。

　　戚曉舟(2017)研究表明，高濃度氨氮脅迫或長時間低濃度氨氮脅迫鯽魚，其腎臟抗氧化基因(GST、CAT、PRX)和免疫相關基因(ILβ、TNFα和CXCL)的表達量低于對照組。關于氨氮脅迫對魚類腸道組織結構影響的報道較少。王琨等(007)表明非離子氨濃度大于0.137mg/L時，幼鯉腸道上皮細胞出現變性、壞死、脫落的情況，與本研究出現的情況相似。在本研究中，慢性氨氮脅迫導致幼鯉腸黏膜上皮細胞部分脫落，腸絨毛受損，但并未對腸絨毛高度和肌層厚度產生顯著影響。這可能與氨氮破壞腸道免疫防御系統有關。

　　熊大林等(2020)研究急性氨氮脅迫對凡納濱對蝦Litopenaeusvannamei的影響，發現腸道免疫指標如酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(ALP)、溶菌酶(LZM)、酚氧化酶原(proPO)以及抗氧化功能指標如總抗氧化能力(AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、熱休克蛋白70(HSP70、熱休克蛋白90(HSP90)等均隨脅迫時間的延長呈先升后降的趨勢。戚曉舟(2017)報道氨氮脅迫會影響鯽魚腸道菌群結構組成，引起腸道菌群結構失衡，從而危害腸道健康。

　　3.2牛至油對氨氮脅迫下鰓、肝、腎和腸道的緩解作用

　　牛至油的主要成分是香芹酚和百里香酚，能夠清除自由基，螯合過渡金屬離子，分解過氧化產物(Zhangetal，2021)，緩解機體氨氮脅迫受到的損傷。研究表明，飼料中添加適量的牛至油能增加幼鯉、斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)、虹鱒(Oncorhyncusmykiss)、錦鯉、斑馬魚(Brachydanioreriovar)、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)肝臟、血液SOD、CAT、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽還原酶(GR)、髓過氧化物酶(MPO)活性和一氧化氮(NO)含量，降低MDA含量(AbdelLatifetal，2020;Zheng，2009;ileretal，2017;Zhangetal，202;ashidianetal，2021;spiritoantoetal，2019;)。

　　機體抗氧化能力的升高有助于清除體內過多的過氧化產物及自由基，降低其對各組織器官的損傷。本試驗中，當牛至油添加量從300mg/kg增加到900mg/kg時，鰓小片卷曲和變粗、變短的程度逐漸減輕，扁平上皮細胞排列逐漸規則，脫落的現象減少;肝細胞空泡化的程度逐漸減輕且出現核偏移的細胞數量逐漸減少;腎小管和腎小囊的損傷減輕，腎小囊腔寬度和腎小球長徑與無氨氮脅迫的對照組相似。這說明適量的添加牛至油有利于緩解慢性氨氮對鰓、肝和腎組織的脅迫。

　　除抗氧化作用外，牛至油增強免疫力的作用亦為其緩解氨氮脅迫起到至關重要的作用。給鯉、錦鯉、斑馬魚、尼羅羅非魚、虹鱒和斑點叉尾鮰飼喂含適量牛至油的飼料后，血清吞噬活力、吞噬指數、溶菌酶活性、補體、IgM顯著升高(AbdelLatifetal，2020;Zhangetal2020;ashidianetal，2021;spiritoantoetal，2019;Dileretal，2017;Zheng，2009)，其感染嗜水氣單胞菌、格氏乳球菌、無乳鏈球菌后的死亡率顯著降低。

　　免疫力的增強有助于損傷組織的修復。Ran等(2016)給雜交羅非魚(O.niloticus♀×O.aureus♂)飼喂含香芹酚和百里香酚混合物(1:1)的飼料，其頭腎巨噬細胞、吞噬活力和血漿溶菌酶活力均增強。牛至油中的百里香酚有抗炎作用，能夠抑制鼠乳腺上皮細胞TNFα和IL的表達(Kuetal，2013)，減少IL的分泌及改善鼠脾細胞IL10/IL的比值(Wlodarskaetal，2015)。

　　香芹酚通過抑制環氧合酶(COX)和環氧合酶(COX)起到抗炎作用(Bimczoketal，2008)。Wlodarska等(2015)表明香芹酚處理顯著上調鼠結腸干擾素γ(IFNγ)的表達水平。hang等(2020)給錦鯉飼喂周含牛至油的飼料后，其腸道腫瘤壞死因子α(TNFα)、轉化生長因子β(TGFβ)表達下調。在嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)感染鯉的試驗中，AbdelLatif等(2020)認為脾臟和頭腎正常組織形態的維持與牛至油上調肝臟炎癥因子白細胞介素β和白細胞介素10(IL1β和IL10)的表達有關。

　　綜上所述，飼料中添加適量的牛至油，在一定程度上能夠緩解慢性氨氮脅迫對幼鯉的鰓、肝、腎以及腸道組織的損傷。對于鰓、肝、腎組織來說，添加量為00mgkg時，牛至油對氨氮脅迫的緩解效果最佳，當牛至油添加量達到200mgkg時，牛至油對慢性氨氮脅迫損傷的緩解作用降低;針對腸道組織而言，牛至油添加量為00、00、00、200mgkg時均可以減輕氨氮脅迫對幼鯉腸道組織的損傷。飼料中添加適量牛至油有利于腸絨毛的生長，促進幼鯉腸道的發育，提高腸道消化吸收的能力，當牛至油添加量達到200mgkg時，牛至油對腸絨毛的促進作用有所減弱。

　　參考文獻

　　陳思涵彭瑞冰黃晨等2018.急性氨氮脅迫對虎斑烏賊肝臟、鰓和腦組織結構的影響[J].水產學報42()：13481357.

　　管敏張德志唐大明2020.慢性氨氮脅迫對史氏鱘幼魚生長及其肝臟抗氧化、免疫指標的影響[J].南方水產科學16()：3642.

　　管敏張德志唐大明，等.2019.慢性氨氮脅迫對子二代中華鱘生長、抗氧化及免疫指標的影響[J].海洋漁業2019,41()：684693.

　　韓慶功宋云義崔艷紅等2016.牛至油對仔豬生產性能、抗體水平及糞便微生物的影響[J].河南農業科學45()：113117.

　　郝丹丹張旭陳嘉等2017.牛至油對成年蛋雞生長性能和免疫功能的影響[J].中國獸醫學報37()：11211127.

　　郝小鳳劉洋凌去非，2012氨氮對泥鰍的急性毒性及對其肝鰓組織超微結構的影響[J].水生態學雜志，33():101107.

　　作者：孟騫騫，張雨晴1,，譚智敏，周針宇，田佳明，謝開英，李萍，沈水寶，王文娟