摘要：通過測定半夏根際土壤及植株不同生長時間不同部位的酚酸類化感物質(zhì)，明確半夏酚酸類化感物質(zhì)積累的規(guī)律，為進一步探明半夏化感自毒作用導致連作障礙提供理論依據(jù)。間隔對半夏塊莖皮、塊莖去皮、葉、須根和根際土壤進行取樣，共取樣次，通過HPLC方法檢測與化感現(xiàn)象密切相關的種酚酸對羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、香草醛、對香豆酸和阿魏酸。半夏植株不同部位及根際土均含與連作土壤相同的種酚酸類成分，含量均在6090時達到最高。半夏須根總酚酸的積累量顯著性高于其他部位<0.05。其中須根又以對香豆酸含量最高;根際土同樣以對香豆酸含量最高。半夏倒苗期左右是連作半夏自毒作用發(fā)生的關鍵時期，此時期的半夏須根酚酸含量最高，其中對香豆酸又占主要地位，高濃度對香豆酸抑制半夏幼苗生長，推測其是主要的酚酸類化感自毒物質(zhì)。

　　關鍵詞：酚酸;半夏;連作障礙;化感作用;積累;植株

　　半夏Pinelliaternata(Thunb.)Breit.作為流通廣泛的大宗藥材，近年來需求量不斷增加，但野生的半夏資源不斷衰減，使得栽培半夏所占的比重越來越大。連作障礙continuouscroppingobstacles;replantproblems;replantdisease，即在同一塊土壤中連續(xù)栽培同種或同科作物時，即使在正常的栽培管理狀況下，也會出現(xiàn)生長勢變?nèi)酢a(chǎn)量降低、品質(zhì)下降和病蟲害嚴重的現(xiàn)象，連作障礙在早期研究中被稱為“土壤病”。

　　連作障礙是藥用植物栽培中的一種常見現(xiàn)象，尤以根或根莖入藥的藥材生產(chǎn)中表現(xiàn)最為突出，如半夏、人參、地黃、三七和丹參等[1−4]都存在著嚴重的連作障礙問題，表現(xiàn)為輕則減產(chǎn)，重則絕收。引起作物連作障礙的主要因素可以歸納為化感自毒作用、土壤微生態(tài)發(fā)生改變，土傳病蟲害嚴重、土壤理化性質(zhì)改變等[5−8]，其中化感自毒作用是目前連作障礙研究熱點之一。李培棟等[9]分析花生ArachishypogaeaLinn.連作土壤中酚酸類化感物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)土壤中對羥基苯甲酸、香草酸、香豆素和苯甲酸會抑制花生幼苗生長并提高花生的發(fā)病率。

　　杜家方等[10]在研究連作地黃RehmanniaglutinosaLibosch.根際土壤中酚酸類物質(zhì)的動態(tài)變化過程中發(fā)現(xiàn)阿魏酸、香豆酸、丁香酸和對羥基苯甲酸酚酸類物質(zhì)會抑制地黃塊根生長，引發(fā)連作效應。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)半夏連作土壤中含有對羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、香草醛、對香豆酸和阿魏酸，這種酚酸均是文獻中經(jīng)常報道的酚酸類化感物質(zhì)，且對半夏的生長發(fā)育具有較強的化感作用[10−11]，故推測半夏的連作障礙現(xiàn)象也與以上酚酸類物質(zhì)所引起的化感自毒作用有關。

　　目前，對半夏酚酸類化感物質(zhì)的積累和分泌少有研究，半夏的酚酸類化感物質(zhì)在不同時期的分泌和積累的研究更是缺乏。實驗針對連作土壤中已分離鑒定的種酚酸類化感物質(zhì)，對不同生長時期的半夏植株、根際土壤中的酚酸類成分進行分析研究，探究半夏植株中種酚酸類成分的積累規(guī)律，為緩解半夏化感自毒作用和消減連作障礙、為提高其產(chǎn)量和質(zhì)量提供理論依據(jù)。

　　1材料與方法(Materialsandethods)

　　1.1材料半夏種莖來源于四川省南充市龍門鎮(zhèn)的野生種莖，直徑1.5~2.0cm。經(jīng)成都中醫(yī)藥大學的李敏教授鑒定，為天南星科植物半夏Pinelliaternata(Thunb.)Breit.的塊莖。方形花盆、河沙、珍珠巖、蛭石和配方全營養(yǎng)液購于廣東天禾農(nóng)資股份有限公司。

　　1.2試劑與儀器

　　1.2.1試劑98%對羥基苯甲酸

　　批號：wkq17060502、99%丁香酸批號：wkq17112307、98%香草酸批號：wkq17112206、98%香草醛批號：wkq17052406、99%對香豆酸批號：wkq17081114和98%阿魏酸批號：wkq17112004均購自成都維克奇生物科技有限公司，上述各對照品質(zhì)量分數(shù)均≥98%。水為蒸餾水，乙腈和磷酸為色譜純，濃鹽酸、氫氧化鈉、乙酸乙酯和甲醇等均為分析純，均購自成都市科隆化學品有限公司。

　　1.2.2儀器

　　WATERSE2695高效液相色譜儀沃特世科技上海有限公司，InertsilODS3C184.6mm×250mmμm色譜柱島津公司;Allegra64RCentrifuge型冷凍離心機BeckmanCoulter;DUG9070B智能型電熱恒溫鼓風干燥箱上海瑯玕實驗設備有限公司;SQP萬分之一天平賽多利科學儀器北京有限公司;PHS3E型劑雷磁上海儀電科學儀器股份有限公司;KQ500DE超聲波清洗器江蘇省昆山市超聲儀器有限公司;SHBⅢS循環(huán)水式多用真空泵鄭州長城科工貿(mào)有限公司;HYBⅡ回旋振蕩器江蘇金怡儀器科技有限公司。

　　1.3方法

　　1.3.1實驗設計

　　取半夏種莖，用蒸餾水反復沖洗，除去泥沙雜質(zhì)。浸泡，消毒，取出瀝干備用。將半夏整齊放置于鋪有潔凈石英砂的育苗盤中，置于溫度為20~23℃的生化培養(yǎng)箱中催苗。待半夏發(fā)芽后，取生長情況一致的半夏移栽至含河沙、珍珠巖和蛭石的混合配方基質(zhì)中，置于20~25℃玻璃人工氣候室中培養(yǎng)，期間每隔澆一次0.075%的全營養(yǎng)液以保證半夏植株正常生長。

　　半夏出苗后15開始取樣，之后每隔半個月對半夏植株進行取樣，每個育苗盤每次取株，共取次。將半夏植株分為須根、塊莖去皮、塊莖皮和葉個部分，50℃烘干備用;收集半夏根際土壤半夏植株取出后小心抖掉粗沙，用軟毛刷刷下附著在須根上面的少量沙子，除去殘根等雜質(zhì)自然風干備用。取半夏種莖，用清水反復沖洗，除去泥沙雜質(zhì)。浸泡，取出瀝干備用。

　　稱取300經(jīng)消毒的潔凈石英砂置于發(fā)芽盒中，移取、.0016、0162、0812、0.1624和0.6496mg·L−的對香豆酸脅迫液各50，加入石英砂中并充分拌勻，同時設置空白對照，每個處理設置組平行實驗。處理后石英砂中酚酸含量分別為0.00、0.27、2.73、13.67、27.33和109.33μ−。取36顆已消毒的半夏種莖種整齊植入處理好的發(fā)芽盒中。將布置好的發(fā)芽盒放入20±)℃的恒溫生化培養(yǎng)箱中，避光培養(yǎng)。

　　色譜條件參考吳立潔等12建立的測定種酚酸的方法，并進行優(yōu)化。WATERSE2695高效液相色譜儀，InertsilOD184.6mm×250mmμm色譜柱，以乙腈0.1%磷酸溶液為流動相進行梯度洗脫，洗脫條件如表所示;流速為∙min−，進樣量10μ;檢測波長為275nm;柱溫為25℃。

　　半夏酚酸含量測定供試品溶液的制備：根際土壤制備方法參考吳立潔等[12]的方法，并進行優(yōu)化。稱取土樣過號篩100，置于500錐形瓶中，加入mo∙−NaOH溶液10，振搖，靜置18，離心，取上清液，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.5左右，000r∙min−離心min，取上清20，加乙酸乙酯40萃取次。

　　合并乙酸乙酯層，減壓濃縮干燥。準確吸取甲醇溶解殘渣，0.22μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。半夏植株各部位半夏酚酸提取參考饒國棟和張建國[13]的方法，并進行優(yōu)化。稱取樣品粉末過號篩，置150錐形瓶中，加mol∙−NaOH50，振搖，靜置18，離心，取上清液，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至.5，000∙min−離心min，取上清10，用乙酸乙酯萃取次，每次20，合并萃取液，減壓干燥。準確吸取甲醇溶解殘渣，0.22μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。對照品溶液的制備：分別精密稱取對羥基苯甲酸、香草醛、香草酸、對香豆酸、丁香酸和阿魏酸對照品，置于10容量瓶中，以甲醇制成每含羥基苯甲酸100μ、香草醛100μ、香草酸100μ、對香豆酸100μ、丁香酸00μ和阿魏酸100μ混合對照品溶液。

　　1.3.4發(fā)芽指標測定

　　待半夏種莖開始發(fā)芽時，每天記錄半夏種莖的發(fā)芽數(shù)，共記錄14。待實驗結束，用刻度尺測定各處理半夏植株的根長。

　　1.3.5評價方法

　　發(fā)芽率萌發(fā)終期正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%;發(fā)芽勢萌發(fā)高峰期正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%，萌發(fā)高峰期指發(fā)芽過程中日發(fā)芽種子數(shù)達到最高峰的時期;發(fā)芽指數(shù)=∑，式中：為在時的種子發(fā)芽數(shù)，為相對應的發(fā)芽時間d);化感效應指數(shù)esponseindexRI采用BruceWiliamson和Richardso[14]的方法：RI=1−當≥時或RI−當<時，式中：RI為化感效應指數(shù)，為對照值指標，為處理值指標。當RI時，表示促進作用，當RI時，表示抑制作用，RI絕對值代表化感作用強度。

　　2結果(Results)

　　吸取供試品溶液、對照品溶液各10μL注入高效液相色譜儀，對半夏根際土及半夏各部位所含酚酸進行定性和定量分析。從半夏植株的須根、塊莖去皮、塊莖皮和葉中均鑒定出種相同的酚酸類成分，分別為對羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、香草醛、對香豆酸和阿魏酸。

　　2.1不同生長時間的半夏須根中酚酸含量的積累變化

　　不同生長時間的半夏須根中酚酸含量測定結果如表所示，半夏須根中總酚酸含量范圍為238.59~578.65μ−，不同生長時間總酚酸含量存在顯著性差異<0.05，隨生長時間的延長，總酚酸含量呈波動上升的趨勢，當生長時間為90時達到最高，約為生長15含量的2.4倍。同一時期各酚酸的含量均有所差異，具體表現(xiàn)為對香豆酸>香草醛>對羥基苯甲酸>香草酸>阿魏酸>丁香酸，含量最高的對香豆酸約為含量最低的丁香酸63倍。隨生長時間的延長，須根中的種酚酸的含量皆呈波動上升的趨勢，且存在顯著性差異<0.05，除丁香酸在60時含量達到最高外，其余種酚酸均在90時含量達到最高。

　　2.2不同生長時間的半夏塊莖去皮中酚酸含量的積累變化

　　不同生長時間的半夏塊莖去皮中酚酸含量測定結果如表所示，半夏塊莖去皮中總酚酸含量范圍為9.86~16.58μ−，不同生長時間總酚酸含量之間存在顯著性差異<0.05，隨生長時間的延長，總酚酸呈先升后降的趨勢，當生長時間為60時達到最高，約為生長15含量的1.7倍。在同一時期半夏塊莖中各酚酸的含量有所差異，具體表現(xiàn)為香草醛>香草酸>對羥基苯甲酸>丁香酸>阿魏酸>對香豆酸，香草醛含量約為對香豆酸的倍。隨生長時間的延長，塊莖去皮中除丁香酸呈逐漸升高的趨勢外，其余種酚酸的含量皆呈先升后降的趨勢，且存在顯著性差異<0.05，對羥基苯甲酸和香草醛在45時含量達到最高，香草酸和阿魏酸在45時含量達到最高，對香豆酸和丁香酸分別在75和90時含量達到最高。

　　2.3不同生長時間的半夏塊莖皮中酚酸含量的積累變化

　　不同生長時間的半夏塊莖皮中酚酸含量測定結果如表所示，半夏塊莖皮中總酚酸含量范圍為324.58~399.91μ−，不同生長時間總酚酸含量存在顯著性差異<0.05，隨生長時間的延長，總酚酸含量呈波動上升的趨勢，當生長時間為90時含量達到最高，約為生長60時含量的1.2倍。半夏塊莖皮中各酚酸的含量有所差異，具體表現(xiàn)為香草醛>香草酸>對羥基苯甲酸>阿魏酸>對香豆酸>丁香酸，香草醛含量約為丁香酸的31倍。隨生長時間的延長，塊莖皮中除對羥基苯甲酸外，其余種酚酸皆呈波動上升的趨勢，且存在顯著性差異<0.05。

　　2.4不同生長時間的半夏葉中酚酸含量的積累變化

　　不同生長時間的半夏葉中酚酸含量測定結果如表所示。總酚酸含量范圍為18.94~70.04μ−，不同生長時間總酚酸之間存在顯著性差異<0.05，隨生長時間的延長，總酚酸呈逐漸上升的趨勢，當生長時間為90時達到最高，約為生長15含量的3.7倍。葉中各酚酸的含量有所差異，具體表現(xiàn)為香草醛>香草酸>對羥基苯甲酸>對香豆酸>丁香酸、阿魏酸，香草醛含量約為丁香酸的倍。隨生長時間的延長，葉中除阿魏酸含量呈先升高后降低的趨勢外，其余種酚酸含量皆呈波動上升的趨勢，且存在顯著性差異<0.05，除香草酸、阿魏酸分別在60和75時含量達到最高外，其余酚酸均在90時含量達到最高。

　　2.5不同生長時間的半夏根際土中酚酸含量的積累變化

　　不同生長時間的半夏根際土中酚酸含量測定結果如表所示，半夏根際土中總酚酸含量范圍為0.5773~1.2694μ−，不同生長時期總酚酸含量存在顯著性差異<0.05，隨時間的延長總酚酸含量呈先升后緩慢下降的趨勢，當生長時間為75時達到最高，約為生長15含量的2.2倍。根際土中各酚酸的含量有所差異，具體表現(xiàn)為對香豆酸>對羥基苯甲酸>香草醛>香草酸>丁香酸>阿魏酸，對香豆酸含量約為阿魏酸含量的22倍。隨生長時間的延長，根際土中除對香豆酸含量呈逐漸升高的趨勢外，其余酚酸的含量皆呈先升后降的趨勢，且存在顯著性差異<0.05，除丁香酸和對香豆酸分別在60和90時含量達到最高外，其余酚酸均在75時含量達到最高。

　　2.6半夏植株不同部位酚酸最終積累量

　　半夏植株不同部位酚酸最終積累量測定結果如表所示，半夏植株不同部位酚酸除丁香酸和對香豆酸外，其余酚酸的最終積累量均存在顯著性差異<0.05，總酚酸積累量以半夏須根最高，塊莖去皮最低，大小規(guī)律為：須根>莖皮>葉>塊莖去皮)(0.01，須根約為塊莖去皮的42倍。半夏植株中種酚酸的積累規(guī)律為：對香豆酸>香草醛>香草酸>對羥基苯甲酸>阿魏酸>丁香酸，其中對香豆酸積累量以須根最高，達410.92μ−，塊莖去皮最低，須根積累量約為塊莖去皮積累量的708倍。對羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、香草醛和阿魏酸則均以塊莖皮積累量最高，塊莖去皮最低。

　　3討論(Discussion)

　　半夏植株各部位總酚酸最終積累量的規(guī)律為須根>塊莖皮葉>塊莖去皮;隨生長時間的延長，半夏植株不同部位中種酚酸不斷積累，均在60~90時達到最高，其中對香豆酸含量最高，且大部分存在于須根中，此時半夏根際土中對香豆酸和總酚酸含量達到最高。實驗所用根際土為石英砂，故最終半夏根際土中對香豆酸和總酚酸均來自半夏植株，推測半夏分泌的酚酸類物質(zhì)對香豆酸占主要地位。

　　半夏塊莖去皮的對香豆酸和總酚酸均是先增加后降低，但最終塊莖去皮的對香豆酸和總酚酸較初始時有所增加的。第天半夏塊莖去皮中對香豆酸和總酚酸開始降低，而第天時半夏須根和塊莖皮中的對香豆酸和總酚酸開始急劇增加，推測半夏塊莖去皮中的對香豆酸和總酚酸均向半夏的須根和塊莖皮中轉(zhuǎn)移。當對香豆酸濃度達到109.33μ−時，能顯著降低半夏種莖的發(fā)芽率，而在第天時半夏須根中的對香豆酸含量為10.92μ−，遠大于脅迫的濃度。

　　據(jù)此可以推測半夏植株會向土壤中釋放酚酸，使得半夏土壤中總酚酸和對香豆酸達到脅迫的閾值，從而使得半夏在連作過程中產(chǎn)生化感自毒作用。何志貴[11]的研究表明，化感自毒物質(zhì)是引起半夏連作障礙的重要因素，其中酚酸是其重要的組成成分。張丹等15的研究表明栽培過程中隨黃連生長年限的增加，連作地土壤中總酚酸的含量均表現(xiàn)為增加。吳立潔等[12]研究發(fā)現(xiàn)，三七根際土壤中對羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、對香豆酸、阿魏酸和苯甲酸種酚酸類物質(zhì)是由三七植物須根殘體腐解產(chǎn)生。

　　徐小軍等[1的研究表明，隨著阿魏酸質(zhì)量濃度的提高，西瓜根和莖中的超氧陰離子濃度及膜質(zhì)過氧化程度顯著增加;張恩平等[1研究發(fā)現(xiàn)，苯甲酸和肉桂酸會破壞番茄根部保護酶系統(tǒng)的平衡，造成了根系的膜質(zhì)過氧化，沈玉聰?shù)萚1在研究酚酸類物質(zhì)對三七幼苗的化感影響時發(fā)現(xiàn)，外源性添加對香豆酸會降低幼苗根系活力和株高。有研究表明，對香豆酸處理幼苗后，植株體內(nèi)可溶性蛋白含量、過氧化氫酶活性、過氧化物酶活性以及超氧化物歧化酶活性均有所降低，從而抑制了小麥的地下根的生長[1。對香豆酸處理大豆后會顯著降低干物質(zhì)產(chǎn)量、葉片膨脹、高度、葉片產(chǎn)量、凈同化率單位葉面積干物質(zhì)產(chǎn)量的比率和葉面積持續(xù)時間處理間隔期間存在的總葉面積20。

　　據(jù)此分析，本研究中當半夏植株的須根中的對香豆酸濃度≥09.33μ−時，須根的抗氧化酶系統(tǒng)皆開始遭到破壞，無法抵抗對香豆酸引起的自毒作用，最終抑制了半夏幼苗的生長發(fā)育，乃至通過影響半夏根系的生長發(fā)育和植株葉片的化合作用引起半夏長期連作的提前倒苗，進而導致減產(chǎn)和土壤病的發(fā)作。推測半夏產(chǎn)地的連作障礙可能是每年半夏采收后殘留的須根殘體經(jīng)腐解后產(chǎn)生了對香豆酸、阿魏酸和對羥基苯甲酸等酚酸類物質(zhì)，對其產(chǎn)生了毒害作用。Ba等[21]研究發(fā)現(xiàn)，煙草的連作降低土壤pH，促進酚酸積累，從而改變細菌群落結構和多樣性，最終影響煙草生長。有研究發(fā)現(xiàn)，對香豆酸通過增加鐮刀菌型等有害菌群，減少有益菌群，改變了黃瓜根際細菌和真菌群落的結構和組成，導致黃瓜發(fā)生自毒效應[22−23]。

　　據(jù)此分析，在半夏產(chǎn)地長期連作過程中，土壤中的對香豆酸不斷積累，在這個過程中對香豆酸可能會改變半夏土壤中的微生物平衡，通過促進有害微生物增加，抑制有益型微生物的生長，從而導致半夏的化感自毒作用。本研究發(fā)現(xiàn)對香豆酸濃度達到較高濃度時能顯著抑制半夏種莖的萌發(fā)，在不同時間段半夏植株各部位酚酸最終積累量均是以半夏須根中對香豆酸含量最高，可以推測半夏植株特別是半夏須根可能是連作土壤中酚酸類化感物質(zhì)的潛在來源，對香豆酸為重要的酚酸類化感物質(zhì)，對香豆酸可能為半夏植株中重要的次生代謝產(chǎn)物，其對半夏植株生長的意義還有待進一步研究。

　　綜上所述，半夏植株不同部位均含相同的種酚酸類成分，分別為對香豆酸、香草醛、香草酸、對羥基苯甲酸、阿魏酸和丁香酸，其總酚酸含量以半夏的須根最高，規(guī)律為須根>塊莖皮葉>塊莖去皮。隨生長時間的延長，半夏的塊莖皮、須根、葉和根際土中的對香豆酸和總酚酸呈波動上升的趨勢，不斷積累，最終在第天時達到最高;而半夏塊莖去皮中的對香豆酸和總酚酸在時達到最高，但此時半夏塊莖去皮的對香豆酸和總酚酸開始向半夏的須根和根際土壤中轉(zhuǎn)移，進一步使半夏須根和根際土在第天時積累的對香豆酸和總酚酸含量達到更高。

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　　作者：萬子玉，李巧，賴月月，劉佳靈，敬勇，李敏

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