摘要 細(xì)菌是一種單細(xì)胞生物, 在自然環(huán)境中具有群體特征與組織化特性. 群體感應(yīng)信號(hào)(quorum sensing, QS)是細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境變化、調(diào)控基因表達(dá)和協(xié)調(diào)群體行為的通訊語(yǔ)言. QS系統(tǒng)廣泛存在于各類微生物(細(xì)菌、真菌、古菌)并調(diào)控多種生理行為, 包括生物發(fā)光、生物被膜(biofilm)的形成、毒力因子的產(chǎn)生和共生關(guān)系的建立等. 然而,鑒于自然界中微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性和功能的復(fù)雜性, QS介導(dǎo)下的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和生態(tài)機(jī)制依然存在未知領(lǐng)域.近年來, 合成生物學(xué)的蓬勃發(fā)展為認(rèn)識(shí)QS效應(yīng)提供了新的契機(jī). 合成生物學(xué)在設(shè)計(jì)遺傳元件庫(kù)、組裝生物裝置、設(shè)計(jì)遺傳電路和創(chuàng)建預(yù)見性群落行為等方面取得了卓越的研究成果; 該方法也為研究QS在調(diào)節(jié)微生物群落的組成和功能上提供了重要工具. 鑒于此, 本文嘗試對(duì)最新的進(jìn)展作一綜述. 首先介紹了QS系統(tǒng)及其主要功能作用和信號(hào)傳導(dǎo)途徑; 其次, 討論了如何利用合成生物學(xué)來設(shè)計(jì)QS過程信號(hào)通路和遺傳電路, 并減少感應(yīng)通路的串?dāng)_; 最后, 評(píng)估了合成感應(yīng)系統(tǒng)的方法以及該方法在微生物種內(nèi)和種間通訊中的表現(xiàn). 本文旨在梳理合成生物學(xué)的先進(jìn)理念, 加深對(duì)基于微生物QS系統(tǒng)構(gòu)建計(jì)算工具、調(diào)控種群密度和代謝流等方面的理解, 拓展合成生物學(xué)手段操縱QS領(lǐng)域的應(yīng)用范圍.

　　關(guān)鍵詞 群體感應(yīng), 合成生物學(xué), 信號(hào)通路, 遺傳電路, 合成菌群

　　自然界中細(xì)菌與其他微生物, 如真菌、古菌和病毒等, 形成了一個(gè)復(fù)雜且動(dòng)態(tài)的微型生態(tài)系統(tǒng)[1]. 該系統(tǒng)的每個(gè)物種都占據(jù)一定的生態(tài)位, 共同參與資源競(jìng)爭(zhēng)和代謝活動(dòng), 發(fā)揮各自的生理功能并最終構(gòu)成相對(duì)穩(wěn)定的生態(tài)網(wǎng)絡(luò)[2]. 群體感應(yīng)(quorum sensing, QS)是微生物分泌的一類代表性化學(xué)感應(yīng)信號(hào), 負(fù)責(zé)協(xié)調(diào)基因表達(dá)、控制細(xì)胞密度和調(diào)節(jié)表觀行為等生理過程.在應(yīng)對(duì)多變的外界環(huán)境時(shí)(生物和非生物因素), QS起著調(diào)節(jié)群體行為、響應(yīng)環(huán)境刺激和維持生態(tài)平衡的作用.目前已報(bào)道的QS信號(hào)分子主要有三類: AI-1型高絲氨酸內(nèi)酯(acyl homoserine lactone, Acyl-HSL)、AI-2型自誘導(dǎo)物-2(autoinducer-2)和寡肽類分子(autoinducing peptides, AIP).

　　信號(hào)交流的過程通常是細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)的整合[3], 當(dāng)信號(hào)物質(zhì)濃度達(dá)到臨界閾值時(shí)被細(xì)胞所感知, 激活或抑制下游目標(biāo)基因[4~6]引發(fā)相應(yīng)的生理反應(yīng), 如分泌毒力因子、形成生物被膜(biofilm)、啟動(dòng)群集運(yùn)動(dòng)及刺激生物發(fā)光等[7,8]. 該機(jī)制廣泛存在于各種微生物, 目前已經(jīng)明確鑒定的有超過100種細(xì)菌可以通過QS調(diào)節(jié)基因的表達(dá); 以模式菌株銅綠假單胞菌(Pseudomona aeruginosa)為例, 其整個(gè)基因組超過6%的基因受QS信號(hào)調(diào)控[9]. 早期的QS研究主要針對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件下純培養(yǎng)的單個(gè)菌株[10,11],通過對(duì)QS的促進(jìn)或抑制來實(shí)現(xiàn)一些目的, 其中對(duì)前者的應(yīng)用主要是增加微生物代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量(如酶類、蛋白、工農(nóng)業(yè)化合物等), 對(duì)后者的應(yīng)用集中于抑制有害菌的數(shù)量或繁殖(如病原菌、生物污損、牙斑垢等).然而, 單一菌種培養(yǎng)物存在產(chǎn)物不純、功能障礙以及調(diào)控不精準(zhǔn)等問題.

　　例如, 利用純培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)二元醇時(shí), 會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)物成分復(fù)雜, 而難以分離純化出目標(biāo)產(chǎn)物的問題[12]; 由單菌發(fā)酵獲得的生物活性酶, 當(dāng)經(jīng)歷異源蛋白過表達(dá)導(dǎo)致的代謝紊亂后, 其活性功能會(huì)嚴(yán)重受阻[13]. 此外, 面對(duì)動(dòng)態(tài)而復(fù)雜的自然環(huán)境, 傳統(tǒng)的QS應(yīng)用手段面臨著效應(yīng)劑量、生態(tài)安全、操控效率等巨大挑戰(zhàn). 為了彌補(bǔ)上述不足, 一些新型手段相繼出現(xiàn), 其中自誘導(dǎo)系統(tǒng)的合成是最早應(yīng)用的方法之一, 它借助于自誘導(dǎo)培養(yǎng)基及其底物, 誘導(dǎo)目標(biāo)菌相關(guān)酶的過量表達(dá), 無需加入額外的誘導(dǎo)劑, 就能實(shí)現(xiàn)高通量篩選多種培養(yǎng)物的目的, 獲得目標(biāo)產(chǎn)物的高產(chǎn)能力[14], 這也被視為合成生物學(xué)的雛形.合成生物學(xué)是一門致力于從零開始重塑生物基因組的學(xué)科. 與基因工程的序列修飾、植入、基因缺失、重組以及堿基移植的做法不同, 合成生物學(xué)的目的在于建立人為可操控的底盤系統(tǒng), 讓它們像電路一樣運(yùn)行. 其核心是從最基本的要素開始, 通過零部件的構(gòu)建和組合來改造自然生命[15]. 簡(jiǎn)單地說, 合成生物學(xué)研究?jī)?nèi)容大體涵蓋三個(gè)層次:

　　一是利用已知功能的天然生物模塊(module)構(gòu)建新型調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并展現(xiàn)出新功能[16]; 二是采用從頭合成的方法構(gòu)建基因組DNA并重構(gòu)生命體; 三是在前兩個(gè)領(lǐng)域的基礎(chǔ)上, 創(chuàng)建完整的全新生物系統(tǒng)乃至人工生命體[17]. 合成生物學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)有相似的邏輯關(guān)系, 可以看作是后者在技術(shù)層面上的拓展, 因此也稱其為“工程生物學(xué)”[18], 有人預(yù)言合成生物學(xué)將是21世紀(jì)新一輪的工業(yè)革命[19,20].在QS領(lǐng)域, 合成生物學(xué)能利用DNA從頭合成的特性和不依賴于現(xiàn)有自然模板的優(yōu)勢(shì), 對(duì)QS系統(tǒng)的行為和過程進(jìn)行特定功能的元件構(gòu)造、遺傳電路合成和菌群搭建. 組裝基于QS的合成電路系統(tǒng), 進(jìn)而實(shí)現(xiàn)調(diào)控菌群的群體功能, 這一策略不僅為揭示QS機(jī)制提供了有效手段, 而且有望通過操控QS系統(tǒng)達(dá)到特定目標(biāo).前期針對(duì)改造QS系統(tǒng)來調(diào)控菌群行為進(jìn)行過一些嘗試. 例如, 在兩株大腸桿菌(Escherichia coli)間建立QS雙向通訊, 通過調(diào)控細(xì)胞自殺基因的表達(dá)水平來模擬微生物之間的捕食或寄生關(guān)系[21]; 利用QS分子-球菌肽(nisin)的模塊化模擬乳酸球菌(Lactococcus lactis)的相互作用模式[22].

　　近年來, 隨著合成生物學(xué)的高速發(fā)展, 該技術(shù)在QS領(lǐng)域的應(yīng)用也飛速進(jìn)步.近年來, 許多學(xué)者對(duì)不同種模式細(xì)菌的QS元件作了詳細(xì)的總結(jié)和論述, 包括QS信號(hào)分子、基因表達(dá)通路和QS通訊網(wǎng)絡(luò)[6,23]; 也有學(xué)者重點(diǎn)關(guān)注微生物群落的QS在環(huán)境中的作用, 討論人為和環(huán)境因素對(duì)QS調(diào)節(jié)過程的影響[24], 及QS調(diào)節(jié)和響應(yīng)機(jī)制[10]. 此外, 還有文獻(xiàn)重點(diǎn)強(qiáng)調(diào)了如何拓展和延伸QS的研究和應(yīng)用領(lǐng)域[9]. 但合成生物學(xué)手段應(yīng)用于群感系統(tǒng)的總結(jié)還不多見. 事實(shí)上, QS系統(tǒng)具有很強(qiáng)的可塑潛力, 這使得它成為生物工程或分子編輯技術(shù)的理想靶標(biāo). 為此, 本文以近十年的文獻(xiàn)為重點(diǎn), 嘗試總結(jié)合成生物學(xué)用于QS研究的一些重要策略, 包括正向調(diào)控、負(fù)向調(diào)控、種內(nèi)通訊和種間通訊等, 并對(duì)合成生物學(xué)構(gòu)建和調(diào)控菌群的應(yīng)用研究進(jìn)行歸納, 旨在更深入地明晰合成生物學(xué)的魯棒性并拓展其應(yīng)用領(lǐng)域的范圍.

　　1 微生物的QS通訊系統(tǒng)

　　QS信號(hào)始于對(duì)海洋烏賊共生微生物費(fèi)氏弧菌(Vibrio fischeri)的研究[25], 該菌的生物發(fā)光依賴LuxI/LuxR感應(yīng)元件對(duì)信號(hào)分子的響應(yīng)[26]. Nealson等人[27]鑒定出這類信號(hào)分子為酰基高絲氨酸內(nèi)酯(acylated homoserine lactone, AHL), 一種由LuxI家族合成酶催化合成的自誘導(dǎo)劑(autoinducer, AI).

　　當(dāng)AHL分子濃度達(dá)到閾值時(shí)會(huì)結(jié)合細(xì)菌表面或細(xì)胞質(zhì)的受體, 進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)與LuxR的調(diào)控因子結(jié)合, 形成LuxI/LuxR復(fù)合系統(tǒng), 作為分泌AHL信號(hào)分子的供體和受體[28].LuxI/LuxR編碼的AHL分子是最經(jīng)典和最廣泛存在的QS物質(zhì), 也是介導(dǎo)革蘭氏陰性菌QS系統(tǒng)主要的自誘導(dǎo)物[29], 如銅綠假單胞菌、耶爾森氏菌(Yersiniaspp.), 大腸桿菌E. coil和洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderia cepacia)等. 細(xì)菌的QS系統(tǒng)并非單一的信號(hào)通路,而是有組織的復(fù)雜集合. 截至目前, 在銅綠假單胞菌中報(bào)道了三種不同屬性的QS分子系統(tǒng), 即LuxI/LuxR, Las和Rhl通路, 分別編碼酰基高絲氨酸內(nèi)酯、3-氧十二烷酰高絲氨酸內(nèi)酯(3-oxo-C12-HSL)和正丁醇基高絲氨酸內(nèi)酯(C4-HSL)[30].

　　此外, 一些革蘭氏陰性菌也被發(fā)現(xiàn)能利用擴(kuò)散信號(hào)因子(diffusible signaling factors,DSF)進(jìn)行交流[31~33].與革蘭氏陰性菌不同, 革蘭氏陽(yáng)性菌既不合成AHL, 也不受LuxI-LuxR系統(tǒng)的控制, 而是由膜表面?zhèn)鞲衅骱图?xì)胞內(nèi)反應(yīng)調(diào)節(jié)其組成的雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(two-component system, TCS)所調(diào)控. 革蘭氏陽(yáng)性菌通過分泌自誘導(dǎo)肽, 并與膜上組氨酸激酶AgrC受體結(jié)合, 在AgrA調(diào)節(jié)蛋白的作用下激活P2/P3啟動(dòng)子產(chǎn)生RNAIII, 促使AgrD酶合成自誘導(dǎo)肽AIP,從而控制基因表達(dá)[34].AHL和AIP是AI-1型系統(tǒng)的典型代表, 分屬于革蘭氏陰性和陽(yáng)性細(xì)菌, 目前AI-1型多集中于種內(nèi)的信息通訊.

　　對(duì)于種間通訊, AI-2較為常見[35,36], 該系統(tǒng)同時(shí)存在于兩類細(xì)菌. 大腸桿菌、弧菌(Vibrio)以及傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)的基因組都含有編碼AI-2型的LuxS酶序列, 這些細(xì)菌的LuxS酶能催化S-核糖同型半胱氨酸(S-ribosyl-homocysteine, SRH)和S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-methionine, SAM)(一種AHL的合成前體)發(fā)生裂解, 產(chǎn)物經(jīng)重排和修飾后形成AI-2,并與細(xì)菌表面受體LuxP/LsrB結(jié)合引發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[37,38].

　　以大腸桿菌為例, 胞內(nèi)的AI-2經(jīng)LsrK激酶磷酸化后, 與LsrR結(jié)合并激活雙向Lsr啟動(dòng)子, 使LsrACDB和LsrK過表達(dá), 加速細(xì)胞對(duì)胞外AI-2信號(hào)分子的結(jié)合與感應(yīng). 除了上述常見的AI-1和AI-2型信號(hào)分子, Hossain和Boon[39]還發(fā)現(xiàn)了一種新的信號(hào)通路, 即一氧化氮(NO)結(jié)合蛋白(NO/NosP), 這一通路主要見于銅綠假單胞菌, 其通過對(duì)低水平的NO產(chǎn)生應(yīng)答來調(diào)節(jié)菌群行為.與原核生物(細(xì)菌)常見的信號(hào)分子相比, 真核生物(真菌)的QS信號(hào)在21世紀(jì)初才被發(fā)現(xiàn)[40]——最先在白色念珠菌(Candida albicans)中發(fā)現(xiàn)一種調(diào)節(jié)種內(nèi)通訊的信號(hào)分子, 即金合歡醇(farnesol), 它能控制白色念珠菌絲狀體的形成, 使其在酵母和菌絲兩種形態(tài)間相互轉(zhuǎn)換. Leonhardt等人[41]探究了白色念珠菌的侵染機(jī)制, 發(fā)現(xiàn)金合歡醇介導(dǎo)了白色念珠菌與宿主細(xì)胞的交流, 并作為毒力因子活化人體先天免疫細(xì)胞來增加炎癥反應(yīng).

　　此外, 已鑒定的真菌QS信號(hào)分子還有金合子酸(farnesoic)、對(duì)羥苯基乙醇(tyrosol)、苯乙醇(phenylethanol)和β-吲哚乙醇(tryptophol)[40]. 對(duì)于合成機(jī)制的解析, 目前研究相對(duì)清楚的是新生隱球菌(Cryptococcus neoformans). 該菌擁有寡肽Qsp1通路,被認(rèn)為是真正意義上的真菌QS系統(tǒng)[42](圖1A). Qsp1信號(hào)分子介導(dǎo)的QS過程, 包括前肽Qsp1的合成、蛋白酶Pqp1的裂解以及Qsp1分子的成熟, 組裝完整的信號(hào)分子經(jīng)寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)體Opt1再次進(jìn)入細(xì)胞, 啟動(dòng)級(jí)聯(lián)反應(yīng)并觸發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo). 目前的研究發(fā)現(xiàn), 釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、莢膜組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum)和粗糙鏈孢菌(Neurospora crassa)的微摩爾級(jí)的信號(hào)分子就能發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng), 且介導(dǎo)的代謝途徑具有種屬差異.

　　鑒于QS信號(hào)在微生物中的重要性, 人們已通過它揭示了多樣的生物學(xué)機(jī)制, 包括毒力因子的產(chǎn)生、微生物被膜的形成、好氧活性污泥的形成機(jī)理、共生關(guān)系和協(xié)同進(jìn)化的建立等[43]. 同時(shí)也獲得了多方面的應(yīng)用, 包括馴化QS菌群處理工業(yè)廢水, 使用QS抑制劑防治海洋污損, 開發(fā)細(xì)菌生物被膜抑制物用于限制病原體感染擴(kuò)散等[44]. 這些都表明QS具有廣泛的應(yīng)用前景, 且對(duì)其深入的挖掘和拓展仍在不斷更新中. 在此背景下一些新的技術(shù)相繼涌現(xiàn), 如合成生物學(xué). 該技術(shù)作為一種新興方式, 近年來在QS領(lǐng)域展現(xiàn)出強(qiáng)勁活力, 并取得了一些革命性成果. 概括來講, 合成生物學(xué)用于QS的策略(圖2)旨在圍繞其核心“設(shè)計(jì)-構(gòu)建-測(cè)試學(xué)習(xí)”的方法, 主要有正向/逆向調(diào)控、種內(nèi)調(diào)節(jié)(邏輯門) /種間調(diào)節(jié)(振蕩調(diào)節(jié)、生物傳感器和數(shù)學(xué)建模)[45,46]及微生物之間的互作網(wǎng)絡(luò)與功能預(yù)測(cè)的輸入/輸出等.

　　2 合成生物學(xué)研究QS系統(tǒng)的理論策略

　　2.1 合成QS信號(hào)通路和基因電路(正向調(diào)控)

　　感應(yīng)元件的構(gòu)建是確保感應(yīng)過程的前提, 理論上講, 不同的QS調(diào)控元件能構(gòu)成邏輯線路, 調(diào)控菌群的感應(yīng)過程. 這使得合成生物學(xué)可針對(duì)性地設(shè)計(jì)和修飾QS元件, 實(shí)現(xiàn)基于密度調(diào)控的遺傳電路和細(xì)胞間通訊.在進(jìn)行基于合成生物學(xué)的QS研究前, 可以根據(jù)細(xì)胞代謝途徑構(gòu)建數(shù)學(xué)模型, 確定聚焦的細(xì)胞表型與反應(yīng)機(jī)制; 隨后利用細(xì)菌中的雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)(two-component regulatory systems, TCRS)組裝遺傳電路[47,48].

　　借助逆啟動(dòng)子和TCRSs的耦合傳感, 實(shí)現(xiàn)合成生物學(xué)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控, 從而對(duì)某些通路和遺傳電路進(jìn)行優(yōu)化. 最初, 惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)合成遺傳電路的建立, 開啟了合成生物學(xué)設(shè)計(jì)QS細(xì)胞特定基因表達(dá)元件的先河, 創(chuàng)造了新的調(diào)控方式, 目前該編輯方法已廣泛應(yīng)用于污染物的降解[49]. 隨后, Hauk等人[50]開發(fā)了基于大腸桿菌AI-2型QS的同源合成遺傳電路, 用于調(diào)節(jié)人源巨噬細(xì)胞刺激因子的表達(dá), 實(shí)現(xiàn)了對(duì)外源和內(nèi)源基因的同步控制. Hwang等人[21]針對(duì)銅綠假單胞菌產(chǎn)生的AHL信號(hào)分子, 設(shè)計(jì)了一種新的合成遺傳電路, 使工程型大腸桿菌獲得了可以靶向捕捉和殺死銅綠假單胞菌的能力.

　　自誘導(dǎo)物AI的合成是正向調(diào)控的典型代表, 因?yàn)樗鼘儆谶z傳電路中的輸入信號(hào), 且具有在液體介質(zhì)或細(xì)胞表面自由擴(kuò)散的能力.除了合成自誘導(dǎo)元件, 建構(gòu)理想的合成共培養(yǎng)物也是正向調(diào)控的方式之一. Malone等人[51]合成了達(dá)到流式細(xì)胞生物膜實(shí)驗(yàn)要求的共培養(yǎng)物——AIP信號(hào)分子, 其可控制金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的Agr信號(hào)通路活性, 揭示了Agr系統(tǒng)對(duì)生物膜的擴(kuò)散能力[52]. Marchand和Collins[53]根據(jù)Agr類信號(hào)系統(tǒng)的原理, 借助共培養(yǎng)技術(shù)分離得到了感應(yīng)AIP信號(hào)的細(xì)胞, 建立了革蘭氏陽(yáng)性菌巨型芽孢桿菌(Bacillus megaterium)種內(nèi)感應(yīng)信號(hào)通路[54]. 這些例證表明, 合成生物學(xué)在設(shè)計(jì)、模擬和編輯QS信號(hào)過程中有從上往下的調(diào)控潛力.

　　2.2 減少感應(yīng)通路的串?dāng)_和擴(kuò)展

　　正交通路(負(fù)向調(diào)控)與源頭開始的正向調(diào)控不同, 負(fù)向調(diào)控主要是解決下游途徑過程中的障礙, 如減少Q(mào)S的過程串?dāng)_. 合成生物學(xué)在開發(fā)多個(gè)通路和設(shè)計(jì)多細(xì)胞系統(tǒng)時(shí), 往往會(huì)受到不可預(yù)見的QS系統(tǒng)串?dāng)_的影響, 而系統(tǒng)內(nèi)部信號(hào)、啟動(dòng)子及兩者之間存在的不同程度的串?dāng)_也會(huì)造成通路和系統(tǒng)功能的喪失[55], 這就限制了QS成分在合成電路和合成菌群中的廣泛使用. 常用于合成遺傳電路的AHL信號(hào)通路, 包括Lux, Las和Rhl系統(tǒng), 它們之間均表現(xiàn)出一定的串?dāng)_現(xiàn)象. 此外, OdDHL和HSL這兩種信號(hào)都能結(jié)合LuxR, 且均能驅(qū)動(dòng)對(duì)應(yīng)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá), 信號(hào)和啟動(dòng)子串?dāng)_的同時(shí)發(fā)生增加了合成生物學(xué)的設(shè)計(jì)難度和操控難度.基于自然界中串?dāng)_的客觀存在, Wu等人[56]首先利用實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這一點(diǎn). 他們將合成生物學(xué)和數(shù)學(xué)建模相結(jié)合, 研究了LuxI和LasR在單應(yīng)變系統(tǒng)中的相互作用, 證實(shí)了細(xì)菌QS系統(tǒng)本身就存在LuxI和LasR之間低水平的串?dāng)_, 觀察到了QS串?dāng)_產(chǎn)生的復(fù)雜行為.

　　為此,如何有效地減少感應(yīng)通路的串?dāng)_問題就顯得非常重要. Brenner等人[57]首次建立了大腸桿菌雙向細(xì)胞間的通訊網(wǎng)絡(luò), 有效減緩了串?dāng)_的發(fā)生; 隨后Pai等人[58]利用銅綠假單胞菌的LasRI和RhlRI系統(tǒng)在兩個(gè)種群間進(jìn)行雙向通訊, 進(jìn)一步降低了系統(tǒng)之間的串?dāng)_等級(jí), 最大限度地保持了種群的一致感應(yīng).除了規(guī)避串?dāng)_, 提升應(yīng)對(duì)復(fù)雜環(huán)境變化的能力也是需要考慮的問題, 這一目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)通常需要多個(gè)信號(hào)通路的組合. 其中, 正交QS通路是最關(guān)鍵的一環(huán), 通路的正交性體現(xiàn)在對(duì)合成電路表達(dá)的宿主細(xì)胞具有特異性且獨(dú)立調(diào)控的基礎(chǔ)上[59], 它是實(shí)現(xiàn)對(duì)活細(xì)胞信號(hào)做出反應(yīng)的工具, 也使混種培養(yǎng)中細(xì)胞自主代謝調(diào)控成為可能.

　　正交QS通路最常用的方式是肽信號(hào), 它在具備高信息含量的同時(shí)也有效地規(guī)避了串?dāng)_的產(chǎn)生.大腸桿菌和巨型芽孢桿菌正交合成通信系統(tǒng)的開發(fā),是基于金黃色葡萄球菌Agr QS系統(tǒng)的AIP肽類信號(hào)進(jìn)行的[53], 這種正交設(shè)計(jì)提升了應(yīng)對(duì)復(fù)雜環(huán)境的能力,同時(shí)也避免了串?dāng)_的發(fā)生. 此外, Scott和Hasty[60]通過修飾Rra和Tra的啟動(dòng)子和受體蛋白, 消除了兩個(gè)通路之間的信號(hào)和啟動(dòng)子的干擾, 將其與已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用的lux和las進(jìn)行組合, 實(shí)現(xiàn)了系統(tǒng)中各條通路的正交搭配, 可用于更復(fù)雜菌群功能的調(diào)控, 還可在此基礎(chǔ)上誘導(dǎo)出新的正交系統(tǒng).

　　不同物種間QS正交通路的開發(fā), 有助于增加合成群落中物種的數(shù)量. Kylilis等人[61]分析了6種酰基高絲氨酸內(nèi)酯的正交性, 結(jié)果表明, 該方法能有效地對(duì)多種細(xì)菌的基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控. 此外, 沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)產(chǎn)生的QS分子與大多數(shù)細(xì)菌的QS系統(tǒng), 包括Lux, Las, Tra, Rhl和Cin通訊途徑都具有正交性, 這為擴(kuò)大正交分子建立新的合成通路提供了理論依據(jù)[62]. Martins等人[63]利用正交的QS分子建立了3個(gè)種群之間的通信, 建模實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了合成正交通路的可行性. 合成生物學(xué)設(shè)計(jì)QS系統(tǒng)主要是依賴于信號(hào)分子, 而信號(hào)分子在時(shí)間和空間上具有自組織特性, 往往不受人工控制. 為了解決這一問題, 將外源誘導(dǎo)劑與QS通路結(jié)合, 可幫助在單細(xì)胞水平和種群水平實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)協(xié)調(diào)[62]. 總之, 誘導(dǎo)QS系統(tǒng)可將更多物種和正交通路進(jìn)行優(yōu)化, 編碼特定基因, 使人工設(shè)計(jì)的多細(xì)胞系統(tǒng)得到更遠(yuǎn)程的控制和更廣泛的應(yīng)用.

　　2.3 分子通訊評(píng)估

　　合成感應(yīng)電路的性能QS是細(xì)菌通訊的一種形式, 合成生物學(xué)利用這一組合的元件構(gòu)建了許多典型的基因電路, 包括基于QS的周期振蕩器、觸發(fā)開關(guān)和邏輯門. 隨著新的基因電路的不斷增加, 擴(kuò)展了更多復(fù)雜的合成QS菌群和通訊網(wǎng)絡(luò), 但這些合成感應(yīng)電路的可靠性需要仔細(xì)評(píng)估. 在眾多的評(píng)價(jià)參數(shù)中, 信道容量是評(píng)價(jià)所有通信系統(tǒng)性能的一項(xiàng)重要指標(biāo), 它是指在特定情況下系統(tǒng)所能輸入和輸出的最大信息量.

　　一種基于細(xì)菌的分子通訊方法——雙端模型, 通過分析由3個(gè)菌群構(gòu)成的合成邏輯電路的質(zhì)量和信道容量, 對(duì)合成感應(yīng)電路的性能進(jìn)行了有效評(píng)估[63]. 該模型是一個(gè)集成的合成電路, 由上級(jí)通路完成產(chǎn)生的信號(hào)激發(fā)下級(jí)通路的運(yùn)行, 該模型借助納米級(jí)的膜, 在水環(huán)境中只允許兩個(gè)輸出端的信號(hào)分子通過, 這樣就能使不同信號(hào)結(jié)合的多種細(xì)菌并行結(jié)合特定的信號(hào)[63]. 合成通信系統(tǒng)的質(zhì)量決定了QS過程的發(fā)展方向和感應(yīng)電路的性能. 在細(xì)菌的合成邏輯門中, 系統(tǒng)接收環(huán)境信號(hào)作為分子輸入, 通過一系列合成遺傳電路和自由擴(kuò)散的通道作為分子輸出[62,64]. 在這一過程, 環(huán)境分子信號(hào)的延遲、分子振幅的差異都會(huì)改變電路的精度、召回率及假陽(yáng)性率, 進(jìn)而影響合成感應(yīng)電路的性能和質(zhì)量[63]. 除了信道容量,其他參數(shù), 如撥動(dòng)開關(guān)、邏輯門等也經(jīng)常用于表征通信系統(tǒng)性能的指標(biāo)[63,65].

　　3 合成生物學(xué)針對(duì)QS的種內(nèi)通訊調(diào)控線路

　　細(xì)菌的QS系統(tǒng)主要分為種內(nèi)通訊和種間通訊兩大類, 目前對(duì)于種內(nèi)通訊的研究主要集中在生物被膜形成、QS猝滅以及環(huán)境監(jiān)測(cè)等方面, 在構(gòu)建計(jì)算工具、調(diào)控種群密度和調(diào)節(jié)代謝流等方面也有部分涉及. 近年來, 合成生物學(xué)針對(duì)上述過程取得的重要進(jìn)展, 主要包括撥動(dòng)開關(guān)、生物傳感器和邏輯門等.

　　3.1 撥動(dòng)開關(guān)

　　生物工程的主要目的是利用多基因重組技術(shù)來提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量, 傳統(tǒng)方式主要是基因敲除和過表達(dá), 但這兩種方式可能會(huì)損害菌體的生長(zhǎng)狀況[66,67].撥動(dòng)開關(guān)是解決這一問題的有力工具, 它可以實(shí)現(xiàn)特定基因的適時(shí)激活和關(guān)閉, 可用于合成基因線路中提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量[68]. 最典型的例子是Gu等人[69]構(gòu)建的aroK撥動(dòng)開關(guān), 它可以精準(zhǔn)控制大腸桿菌莽草酸酯合成途徑中蛋白活性和關(guān)鍵酶的表達(dá), 減少不必要的能量消耗, 最終使野生型大腸桿菌分泌莽草酸產(chǎn)量高達(dá)13.15 g/L, 成功構(gòu)建了基于撥動(dòng)開關(guān)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型合成莽草酸鹽的大腸桿菌工程菌株.

　　在此基礎(chǔ)上, 近年來通過撥動(dòng)開關(guān)與QS系統(tǒng)相結(jié)合, 構(gòu)建了諸多新的基因線路來實(shí)現(xiàn)細(xì)菌群體的種內(nèi)通訊以實(shí)現(xiàn)特定的目的. Swofford等人[70]構(gòu)建了lux QS系統(tǒng)和綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)報(bào)告基因耦合開關(guān),并將其整合到非致病性沙門氏菌中, 通過對(duì)小鼠體內(nèi)的定位發(fā)現(xiàn)新構(gòu)建的開關(guān)能作為一種生物標(biāo)記(biomarker)對(duì)腫瘤進(jìn)行靶向治療. Soma和Hanai[71]在大腸桿菌中構(gòu)建了一個(gè)捆綁lux系統(tǒng)和代謝撥動(dòng)開關(guān)(metabolic toggle switch)調(diào)節(jié)器, 利用該調(diào)節(jié)器可實(shí)現(xiàn)代謝流從三羧酸循環(huán)到異丙醇生產(chǎn)的重新定向, 大幅提高了異丙醇的產(chǎn)量. 此外, Gupta等人[72]設(shè)計(jì)了依托QS機(jī)制的pfk-1基因(參與糖酵解), 可根據(jù)發(fā)酵時(shí)間和細(xì)胞密度來確定基因開啟的最佳點(diǎn). 當(dāng)AHL不存在時(shí)以合成葡萄糖為主, 當(dāng)AHL積累到一定閾值后會(huì)關(guān)閉pfk-1基因的表達(dá), 啟動(dòng)肌醇(myoinositol, MI)的產(chǎn)生.

　　近年來, 隨著研究的深入, 撥動(dòng)開關(guān)的應(yīng)用已從單一代謝路徑進(jìn)入到了多重動(dòng)態(tài)途徑. 其中, Doong等人[73]的研究最具代表性. 他們構(gòu)建了涉及兩個(gè)動(dòng)態(tài)調(diào)控的機(jī)制, 這種機(jī)制可實(shí)現(xiàn)分層調(diào)控, 獨(dú)立調(diào)節(jié)兩種不同酶的表達(dá), 從而提高D-葡萄糖醛酸的產(chǎn)量. 在這種開關(guān)的調(diào)解下, 可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞“生長(zhǎng)模式”與“生產(chǎn)模式”的切換; 相應(yīng)的, 其下游產(chǎn)物(MI和D-葡萄糖醛酸)也可以得到相應(yīng)控制. 此外, 多重調(diào)控開關(guān)也在Cui等人[74]的研究中得到了進(jìn)一步展示. 他們構(gòu)建了基于兩個(gè)天然啟動(dòng)子即PabrB和PspoiiA的雙功能模塊化系統(tǒng).通過改變啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)、數(shù)目和序列, 構(gòu)建了一個(gè)具有上調(diào)和下調(diào)能力的啟動(dòng)子庫(kù). 然后, 將雙功能模塊化系統(tǒng)運(yùn)用到枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)中進(jìn)行甲萘醌-7(menaquinone-7)的生產(chǎn), 通過該動(dòng)態(tài)途徑調(diào)控后甲萘醌-7的產(chǎn)量提高了近40倍.

　　3.2 生物傳感器與撥動(dòng)開關(guān)類似, 生物傳感器是另一種作為調(diào)節(jié)的元件應(yīng)用于合成生物學(xué)研究QS系統(tǒng)的方式[77]. 最早的生物傳感器是核糖開關(guān), 一種適體結(jié)構(gòu)域和表達(dá)結(jié)構(gòu)域的組合, 可以通過感應(yīng)底物濃度來實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)[78]. Pang等人[79]開發(fā)了一種N-乙酰神經(jīng)氨酸(NeuAc)核糖開關(guān), 利用該調(diào)節(jié)器可對(duì)一些途徑和關(guān)鍵酶進(jìn)行優(yōu)化, 如提高NeuAc的產(chǎn)量. 隨后,Raut等人[80]優(yōu)化了基于哈維氏弧菌(V. harveyi)BB170菌株的AI-2型全細(xì)胞傳感系統(tǒng). 當(dāng)AI-2進(jìn)入細(xì)胞后會(huì)與LuxP結(jié)合, 進(jìn)而啟動(dòng)LuxCDABE的轉(zhuǎn)錄, 促進(jìn)熒光素酶及其底物的表達(dá), 最終導(dǎo)致生物發(fā)光.

　　目前該系統(tǒng)可為炎癥性腸病早期的診斷提供便捷方法. Wen等人[81]構(gòu)建了一種在無細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)中的模塊化DNA編碼傳感器, 它可以在納摩爾水平上定量檢測(cè)痰樣品中的QS信號(hào)分子3-oxo-C12-HSL, 提高囊性纖維化疾病的診斷速度. 此外, 光生物傳感器與基于蛋白酶的動(dòng)態(tài)雙調(diào)控開關(guān)應(yīng)用于大腸桿菌工業(yè)化生產(chǎn), 其中光生物傳感器將核酸介導(dǎo)的信號(hào)放大, 得到基因表達(dá)量所對(duì)應(yīng)的大腸桿菌密度范圍, 加上位點(diǎn)特異性DNA重組酶和細(xì)胞裂解酶建立起的兩個(gè)獨(dú)立系統(tǒng), 對(duì)信號(hào)結(jié)果做出反饋.

　　這一策略解決了大腸桿菌在細(xì)胞工廠中存在的合成效率低的問題, 通過調(diào)節(jié)大腸桿菌細(xì)胞的C/D周期, 改變細(xì)胞的比表面積和細(xì)胞體積, 進(jìn)而調(diào)控不同產(chǎn)物的生產(chǎn)強(qiáng)度和耐受性, 實(shí)現(xiàn)代謝流的精準(zhǔn)分配[81].除了醫(yī)學(xué)診斷和細(xì)胞代謝工程, 生物傳感器在生態(tài)環(huán)保方面也提供了有力的幫助, 如汞污染. Cai等人[82]利用QS的正反饋系統(tǒng)與汞特異性操縱子MerR,構(gòu)建了一種依賴Hg2+離子的可調(diào)MerR蛋白, 并在此基礎(chǔ)上組裝構(gòu)建了對(duì)汞特異性的生物傳感器. 通過含MerR蛋白的汞特異性操縱子來控制LuxI的表達(dá), 形成的LuxI-AHL復(fù)合物具備依次激活Prlux并表達(dá)RFP的能力. 將該方法擬合到經(jīng)典的Hill方程, 研發(fā)出超靈敏的汞污染檢測(cè)探針. 此外, Thapa等人[83]利用光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)的原理,

　　4 合成生物學(xué)針對(duì)QS的種間通訊調(diào)控線路

　　細(xì)菌在自然界中并非獨(dú)立存在, 它們之間相互影響, 不論是在大氣、海洋、土壤中, 還是在生物體內(nèi),既存在依附關(guān)系, 也存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系. 微生物多以混居共生的方式生存在一起, 彼此之間形成復(fù)雜的種群交互.因此, 細(xì)菌除了種內(nèi)交流, 也通過種間交流的方式來啟動(dòng)特定基因的表達(dá), 從而控制整個(gè)群落的狀態(tài), 提高整個(gè)群體的生存能力[87]. 合成生物學(xué)在種間調(diào)控中的行為主要包括: 密度控制、振蕩子和微生物的共培養(yǎng)等.

　　4.1 密度控制微生物生長(zhǎng)環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)物通常有限, 而且相對(duì)擁擠的環(huán)境也不利于微生物的生長(zhǎng)[88,89]. 因此, 調(diào)控種群生物量對(duì)于提高產(chǎn)物得率具有重要意義. Wang等人[90]通過將糖酵解途徑、戊糖磷酸途徑和“雙歧分流”相結(jié)合, 在大腸桿菌中構(gòu)建了一個(gè)EPbifido途徑. 將該途徑應(yīng)用于PHB、甲羥戊酸和脂肪酸的生產(chǎn), 可以很好地降低二氧化碳排放量并提高產(chǎn)物的摩爾轉(zhuǎn)化率.Patidar等人[91]以扁藻(Tetraselmis striata)和橄欖菌(Pelagibaca bermudensis)為研究對(duì)象, 采用階段共培養(yǎng)模式評(píng)估了不同脅迫條件下生物燃料的生產(chǎn)情況. 結(jié)果表明, 橄欖菌及其代謝物可以與扁藻相互促進(jìn), 從而提高脂質(zhì)產(chǎn)量, 其主要原理是HHQ和PQS增加了橄欖菌的細(xì)胞豐度, 在生物表面形成生物膜, 放大了互惠互利的共生效應(yīng).

　　此外, Chen等人[92]使用兩種不同的QS系統(tǒng)構(gòu)建了“激活”和“阻遏”菌株, 其中“激活”菌株(rhl系統(tǒng))在rhl-AHL信號(hào)分子存在下可激活兩種菌株中目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄, 而“阻遏”菌株(cin系統(tǒng))在cin-AHL信號(hào)分子存在下通過表達(dá)阻遏物L(fēng)acI降低兩種菌株中靶基因的轉(zhuǎn)錄. 這種雙QS系統(tǒng)構(gòu)建的共培養(yǎng)體系具有很強(qiáng)的適應(yīng)性, 可成功地實(shí)現(xiàn)種群密度的動(dòng)態(tài)調(diào)控.另外, 在種群之間調(diào)控機(jī)制的解析上, 一些生態(tài)學(xué)家嘗試通過構(gòu)建一些小型的合成生態(tài)系統(tǒng)來進(jìn)行探索. Scott等人[93]利用lux和rpa系統(tǒng)設(shè)計(jì)了以鼠傷寒沙門氏桿菌兩個(gè)菌株同步裂解為動(dòng)態(tài)調(diào)控核心的共培養(yǎng)系統(tǒng).

　　在該系統(tǒng)中, 兩個(gè)菌株分別攜帶lux和rpa系統(tǒng),并表達(dá)對(duì)應(yīng)的信號(hào)分子lux-AHL和rpa-AHL; 隨著共培養(yǎng)菌株密度的增長(zhǎng), 當(dāng)兩個(gè)菌株中各自的AHL分子濃度達(dá)到一定的閾值時(shí), 將分別激活對(duì)應(yīng)的啟動(dòng)子并促使細(xì)胞裂解蛋白X174的表達(dá), 造成菌株裂解, 以達(dá)到調(diào)控種群密度的目的. Stephens等人[94]基于AI-2的誘導(dǎo)特性, 在大腸桿菌中構(gòu)建了一種新型的雙菌, 即銅綠假單胞菌共培養(yǎng)系統(tǒng), 并成功實(shí)現(xiàn)種群密度比例的動(dòng)態(tài)調(diào)控以及預(yù)測(cè). 該系統(tǒng)首先構(gòu)建了一個(gè)能感應(yīng)AI2并能將其轉(zhuǎn)化為正交QS信號(hào)AI-1的菌株; 產(chǎn)生的AI1信號(hào)可自由擴(kuò)散進(jìn)入第二菌株, 并激活PtsH蛋白表達(dá), 借助葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng), 通過動(dòng)態(tài)控制第二菌株的生長(zhǎng)速率來達(dá)到調(diào)節(jié)菌群比例的目的.

　　4.2 振蕩子在基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中存在少量具有全局性行為的調(diào)控因子, 它們能夠調(diào)控多種代謝活動(dòng), 如種群生物量[95]、激素分泌和晝夜節(jié)律等[96,97], 這與基因的振蕩性有關(guān), 所以構(gòu)建合成基因振蕩器成為合成調(diào)控研究的方向之一. Prindle等人[98]將信號(hào)強(qiáng)卻僅適用短程傳輸?shù)腝S系統(tǒng)與信號(hào)弱卻適用遠(yuǎn)程傳輸?shù)难趸�還原信號(hào)系統(tǒng)相結(jié)合, 利用過氧化氫氣體的快速傳播能力, 實(shí)現(xiàn)了更大范圍群體的同步周期性行為, 并提高了生活史的周期性精度. 基于新的系統(tǒng), 該團(tuán)隊(duì)還開發(fā)了一種砷元素感受器, 能精準(zhǔn)地反應(yīng)環(huán)境中砷的濃度, 并由上百個(gè)小菌落組成的陣列通過不同的振蕩頻率表現(xiàn)出來[98].

　　Chen等人[92]通過整合兩套QS體系, 構(gòu)建了由激活型菌與抑制型菌組成的混合菌群, 使兩個(gè)不同基因組成的細(xì)菌群體在基因表達(dá)上產(chǎn)生相互依賴的同步振蕩. 此外, Prindle等人[98]通過整合振蕩器、群體間的氣相氧化還原信號(hào)和lux系統(tǒng), 在不同的菌落間形成耦合的遺傳“生物混合體”. 當(dāng)不含亞砷酸鹽時(shí), ArsR會(huì)抑制luxR的表達(dá), 從而無熒光和振蕩的產(chǎn)生. 但當(dāng)亞砷酸鹽含量足夠時(shí), 這種抑制作用會(huì)被解除, LuxR-AHL復(fù)合物將會(huì)促進(jìn)熒光基因的表達(dá)和產(chǎn)生振蕩, 最終實(shí)現(xiàn)數(shù)千個(gè)振蕩群體在厘米尺度上的同步. 這些研究表明,QS系統(tǒng)和振蕩子模型相結(jié)合在調(diào)控微生物聯(lián)合體同步性方面具有很大潛力, 有利于代謝工程的實(shí)際應(yīng)用,特別是開發(fā)和優(yōu)化高價(jià)值代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)途徑.

　　5 合成生物學(xué)基因電路的魯棒性

　　合成菌群是基于基因電路的設(shè)計(jì)策略而構(gòu)建的,菌群的規(guī)模取決于微生物之間的互作, 動(dòng)力學(xué)和穩(wěn)定性的特征, 以及不同時(shí)間和空間的微生物群落的穩(wěn)態(tài)協(xié)調(diào)等[103], 這需要很強(qiáng)的魯棒性. 基因線路在合成之后, 其魯棒性是后期實(shí)驗(yàn)中重點(diǎn)考察的指標(biāo), 它決定了未來在合成基因線路和網(wǎng)絡(luò)功能表達(dá)的精準(zhǔn)性和長(zhǎng)期性, 這對(duì)設(shè)計(jì)和構(gòu)建基因電路的原則和計(jì)算具有嚴(yán)格要求.細(xì)胞之間的競(jìng)爭(zhēng)、拮抗和共生的關(guān)系, 受外界各種波動(dòng)因素的影響, 這使得種群一直處于動(dòng)態(tài)變化之中. 隨著時(shí)間、空間的推移和變換, 不同生態(tài)位的細(xì)菌種群發(fā)生基因組進(jìn)化和水平基因轉(zhuǎn)移的概率升高[104]. 合成基因電路中的工程基因易產(chǎn)生變異, 因而在短時(shí)間內(nèi)電路失去其特定的功能, 表現(xiàn)出一種“功能正常”的假象, 通過繼續(xù)利用體系中的底物而產(chǎn)生非理想化的表型[105,106]. 因此, 基因電路的魯棒性和穩(wěn)定性是合成菌群必須考慮的參數(shù), 并在整個(gè)合成菌群的生命周期對(duì)其進(jìn)行測(cè)試. 有學(xué)者在延長(zhǎng)基因電路的魯棒性和穩(wěn)定性方面, 提出了降低宿主細(xì)胞的突變率和避免易突變?cè)O(shè)計(jì)的策略, 并強(qiáng)調(diào)了宿主細(xì)胞電路元件的魯棒性策略[106].目前, 對(duì)于已知的QS串?dāng)_和干擾, 電路的魯棒性源自兩方面.

　　一方面, 由于合成群落的細(xì)胞平均分擔(dān)來自輸入端的化學(xué)信號(hào), 當(dāng)接收到變化的信號(hào)時(shí)可有效地離散化, 錯(cuò)誤電路因此終止, 減少細(xì)胞突變的影響; 另外一方面, 電路發(fā)生到被檢測(cè)到, 存在時(shí)間上的延遲,借助遺傳編程的邏輯門和化學(xué)線路的細(xì)胞魯棒性對(duì)其進(jìn)行計(jì)算, 不僅可以提高種群對(duì)電路各級(jí)反應(yīng)的響應(yīng),也增強(qiáng)系統(tǒng)對(duì)出錯(cuò)和抗干擾影響的能力[67]. 化學(xué)信號(hào)結(jié)合這種細(xì)胞間的離散化, 是合成生物學(xué)電路設(shè)計(jì)的一種方法和原則, 旨在克服各級(jí)層電路觸發(fā)的隨機(jī)性,而時(shí)間和空間上的協(xié)調(diào), 則需對(duì)遺傳程序的設(shè)計(jì), 對(duì)實(shí)現(xiàn)遺傳表達(dá)時(shí)間的異步計(jì)算, 這種計(jì)算操作有助于設(shè)計(jì)和構(gòu)建具有魯棒性和穩(wěn)定性的基因電路[107].然而,由于自然界中微生物存在混雜的QS串?dāng)_及其影響, 這在計(jì)算和測(cè)試中不易被預(yù)知, 串?dāng)_對(duì)基因的調(diào)控和細(xì)胞表型會(huì)產(chǎn)生什么影響, 也會(huì)帶給設(shè)計(jì)電路一些無法規(guī)避的知識(shí)盲區(qū). 因此, 未來的研究中需要各學(xué)科的交叉和融合, 以開發(fā)更多新的策略用于深入研究.6 合成生物學(xué)調(diào)控QS的應(yīng)用基于目前對(duì)細(xì)菌QS系統(tǒng)機(jī)制的認(rèn)識(shí), 合成生物學(xué)設(shè)計(jì)可靠的遺傳電路, 調(diào)控QS過程和細(xì)菌的基因表達(dá),賦予工程菌群新的生物功能[108,109]. 這一策略已用于疾病治療、環(huán)境治理和海洋生態(tài)保護(hù)等.

　　6.1 疾病治療改變細(xì)胞-細(xì)胞間的通訊系統(tǒng), 開發(fā)新型抗生素是合成生物學(xué)用于疾病領(lǐng)域的早期嘗試[110]. 一些植物提取物可以誘發(fā)群體淬滅, 降低AI-2和AHL活性并最終阻止毒力基因的表達(dá)[111]. 海洋藻類中開發(fā)的呋喃酮和QS裂解酶是最典型的群體淬滅劑. 其他來源的淬滅劑也相繼被發(fā)現(xiàn), 如環(huán)硫化合物(cyclic sulfur compounds)、青霉素酸(penicillin acid)等, 這些化合物都能抑制QS自誘導(dǎo)劑AHL的產(chǎn)生, 以阻斷QS通路, 進(jìn)而影響毒力基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[112,113]. 此外, 近期針對(duì)SAM抑制劑的研究也在積極地探索中, 因?yàn)樗�是自誘導(dǎo)劑AHLs和AI-2合成的輔助因子[114]. 破壞了輔助因子的生成, 也就降低了下游信號(hào)分子合成的概率.在實(shí)際醫(yī)學(xué)應(yīng)用中, 針對(duì)LuxI/LuxR應(yīng)用合成生物學(xué)控制大腸桿菌的數(shù)量是早期例子之一.

　　You等人[115]在大腸桿菌中設(shè)計(jì)了利用費(fèi)氏弧菌來源的LuxI/LuxR調(diào)控細(xì)胞凋亡來控制群體數(shù)量的基因線路, 他們將細(xì)胞凋亡基因ccdB置于LuxR結(jié)合的PLuxI啟動(dòng)子控制下.當(dāng)環(huán)境中信號(hào)分子AHL達(dá)到閾值時(shí), LuxR與AHL結(jié)合,啟動(dòng)ccdB 基因的轉(zhuǎn)錄, 從而引起程序性死亡, 通過該方法可對(duì)病原菌生物量進(jìn)行很好地控制. Hong等人[116]基于對(duì)生物被膜信號(hào)通路的研究, 通過控制枯草芽孢桿菌信號(hào)分子的表達(dá), 設(shè)計(jì)出一種工程生物被膜,這種新型被膜可以分泌多種抗菌肽來抑制硫酸鹽細(xì)菌(sulfate-reducing bacterium, SRB)的生長(zhǎng), 從而降低該菌的侵蝕作用.

　　類似的方法也應(yīng)用于其他細(xì)菌中, 將結(jié)核桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的INV基因(編碼侵襲素)和費(fèi)氏弧菌的LuxI-R功能模塊共同導(dǎo)入大腸桿菌中, 使其能夠在選擇性條件下具有癌細(xì)胞侵入能力, 從而找到殺滅癌細(xì)胞的新方法[117]. Hwang等人[118]研發(fā)了一種編碼抗生物被膜的基因合成遺傳系統(tǒng), 使大腸桿菌合成綠膿桿菌素裂解銅綠假單胞菌, 抑制其生物被膜的形成, 用于預(yù)防腸道感染. 近期的研究中進(jìn)一步拓展了研究的深度. Sedlmayer等人[119]基于合成生物學(xué)原理, 提出了通過閉環(huán)式調(diào)控QS過程從而減輕銅綠假單胞菌對(duì)人體毒性的設(shè)想. 在隨后的研究中[120], 他們成功構(gòu)建了一個(gè)既能降低白色念珠菌毒性, 又不會(huì)造成合成遺傳通路障礙的系統(tǒng).

　　上述研究中的核心實(shí)驗(yàn)是利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞上的甲酰肽傳感器感應(yīng)多種細(xì)菌分泌的甲酰多肽, 進(jìn)而強(qiáng)化AI-2信號(hào)傳遞的QS效應(yīng), 抑制白色念珠菌生物被膜的形成[120]. 該研究驗(yàn)證了細(xì)胞通過合成生物學(xué)可將其設(shè)計(jì)為病原菌自動(dòng)識(shí)別和“防御衛(wèi)士”的這一猜想.基因編輯工具的出現(xiàn)也助推了生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用. 有研究者提出通過合成生物學(xué)方法對(duì)CRISPR-Cas免疫系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)控的設(shè)想[121]. 生態(tài)模型的初步研究結(jié)果顯示, 如果將合成生物學(xué)與基因組編輯相結(jié)合, 設(shè)計(jì)疾病相關(guān)的遺傳電路以強(qiáng)化免疫系統(tǒng), 便可促進(jìn)人體免疫細(xì)胞對(duì)病原菌的抵抗力; 同時(shí), 也可反向思維對(duì)QS系統(tǒng)進(jìn)行破壞, 抑制其生物被膜的發(fā)育, 從而降低銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、類鼻疽伯克氏菌(Burkholderia pseudomallei)和霍亂弧菌(Vibrio cholerae)的感染率[121]. 以此為背景, 通過合成生物學(xué)編輯益生菌, 改造免疫幫手的御敵能力抑或是未來診斷和治療疾病的新趨勢(shì).

　　7 總結(jié)與展望

　　現(xiàn)代分子生物學(xué)、代謝工程和基因組學(xué)在QS領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用, 推進(jìn)了對(duì)微生物群體未知領(lǐng)域的探索.目前已知的QS信號(hào)通路和網(wǎng)絡(luò), 在預(yù)防疾病、生態(tài)修復(fù)和海洋抗生物污損方面得到了較為深入的應(yīng)用. 考慮到生態(tài)、環(huán)境以及醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域邊界廣、尺度大等現(xiàn)狀, 仍存在許多問題亟待解決. 這些問題的克服需要開發(fā)更加先進(jìn)的技術(shù), 以及發(fā)展生物、化學(xué)、數(shù)學(xué)和計(jì)算方法, 從個(gè)體和系統(tǒng)層次來集成和系統(tǒng)操作.未來需要考慮和可以嘗試的方向如下。

　　(1) 合成方法的抗干擾性. 細(xì)菌個(gè)體極易受生物和非生物因素的影響, 如何確定合成菌群表型和突發(fā)行為發(fā)生的概率, 構(gòu)建更為成熟的可預(yù)測(cè)菌群動(dòng)態(tài)變化的群落模型是今后亟待加強(qiáng)的方向之一.(2) 合成應(yīng)用的環(huán)境真實(shí)性. 由于實(shí)驗(yàn)室條件無法真實(shí)反映微生物生態(tài)系統(tǒng)的復(fù)雜性. 因此, 基因設(shè)計(jì)的底盤細(xì)菌開發(fā)尤為重要, 這不僅可以滿足未來合成生物學(xué)設(shè)計(jì)遺傳電路和復(fù)雜群落的需求, 也有望將其從實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)移到自然生態(tài)系統(tǒng)中應(yīng)用. 機(jī)器學(xué)習(xí)、生物信息和基因編輯技術(shù)的有效輔助, 可使合成生物學(xué)對(duì)遺傳電路實(shí)現(xiàn)更為精準(zhǔn)、模塊化的設(shè)計(jì), 從而構(gòu)建人工智能化調(diào)控的個(gè)性化功能生物網(wǎng)絡(luò).(3) 合成生物學(xué)聚焦目標(biāo)的拓展. QS信號(hào)的應(yīng)用研究目前大多數(shù)主要是針對(duì)AI-1信號(hào)通路的設(shè)計(jì), 而對(duì)AI-2和AIP的研究較少. 而一些非常見環(huán)境或極端環(huán)境(深海、深地、深空), 新型真菌、細(xì)菌和古菌均有待深挖. 這些微生物具有AI-2和AIP的能力, 針對(duì)這兩種QS系統(tǒng)進(jìn)行合成生物學(xué)的改造, 并用于工程系統(tǒng)的設(shè)計(jì)和構(gòu)建, 從而使QS的應(yīng)用得到延伸.

　　(4) 應(yīng)用生境的衍生. 針對(duì)較少記錄的特殊生境,如極地、熱液、冷泉、臨近空間等極端環(huán)境, 有望挖掘到一些新的機(jī)制, 例如環(huán)境適應(yīng)機(jī)制(耐壓、耐熱、嗜冷、抗紫外線等), 新型物質(zhì)代謝機(jī)制(化能途徑)以及協(xié)同進(jìn)化過程等.(5) “分子編程”的應(yīng)用. 為了提高目標(biāo)產(chǎn)物的得率,需要對(duì)影響QS系統(tǒng)的各種因素進(jìn)行深入分析, 輔以數(shù)學(xué)模型為微生物生長(zhǎng)過程進(jìn)行“編程”. 將其長(zhǎng)時(shí)間維持在所需要的濃度, 通過延長(zhǎng)穩(wěn)定期、指數(shù)期以便更有效地控制發(fā)酵過程, 使微生物始終處于最佳工作狀態(tài). 對(duì)微生物的各種代謝途徑進(jìn)行精準(zhǔn)“編程”, 構(gòu)建更高效的“恒化器”或“恒濁器”, 使它們能像工業(yè)化設(shè)備一樣生產(chǎn)人們所需的各種產(chǎn)品.

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　　作者：徐梅婷1,2, 程珂珂1, 曾艷華1, 周進(jìn)1*, 陳國(guó)福3