摘要嵌合抗原受體T細(xì)胞(chimericantigenreceptorTcell，CAR-T)是通過(guò)基因工程技術(shù)將自體或異體T細(xì)胞改造成針對(duì)腫瘤特異性抗原的新型殺傷細(xì)胞，具有特異性強(qiáng)、效率高、非MHC限制等優(yōu)點(diǎn)，在復(fù)發(fā)/難治性血液系統(tǒng)腫瘤和部分實(shí)體瘤中取得了良好的治療效果。CAR-T細(xì)胞制備流程包括細(xì)胞分離和純化、活化和分化、基因修飾、體外擴(kuò)增、表型質(zhì)控、保存和回輸。近年來(lái)，隨著流式細(xì)胞術(shù)的迅速發(fā)展，使其廣泛應(yīng)用于CAR-T細(xì)胞治療的各個(gè)環(huán)節(jié)，包括治療前篩查、體外制備和回輸后監(jiān)測(cè)，并在其創(chuàng)新優(yōu)化過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。

　　關(guān)鍵詞流式細(xì)胞術(shù);CAR-T細(xì)胞;治療前篩查;細(xì)胞制備;回輸后監(jiān)測(cè)

　　細(xì)胞免疫治療是繼外科手術(shù)、化療、放療后第4種具有顯著優(yōu)勢(shì)及臨床療效的抗腫瘤治療方法。作為細(xì)胞免疫治療的重要組成部分，過(guò)繼細(xì)胞治療利用內(nèi)源性的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TIL)或基因工程編碼表達(dá)T細(xì)胞受體(TCR)或嵌和抗原受體(CAR)的T細(xì)胞，在腫瘤免疫治療領(lǐng)域表現(xiàn)出顯著的臨床療效和可觀的研究前景。

　　醫(yī)學(xué)論文投稿刊物：《免疫學(xué)雜志》由中國(guó)免疫學(xué)會(huì)和第三軍醫(yī)大學(xué)主辦，1985年創(chuàng)刊，現(xiàn)為月刊，A4開本，內(nèi)文92頁(yè)，銅板紙、彩圖隨文印刷，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)連續(xù)出版物號(hào)：ISSN：1000—8861，國(guó)內(nèi)統(tǒng)一刊號(hào)：CN51—1332/R。本刊堅(jiān)持以交流學(xué)術(shù)信息、開展學(xué)術(shù)爭(zhēng)鳴、繁榮學(xué)術(shù)園地為其辦刊辦刊宗旨;為本學(xué)科及相關(guān)學(xué)科讀者充實(shí)理論、更新知識(shí)、積累經(jīng)驗(yàn)服務(wù)為其目的。

　　2017年FDA相繼批準(zhǔn)Kymriah和Yescarta2種CAR-T產(chǎn)品上市，分別用于治療難治/復(fù)發(fā)性(R/R)的B細(xì)胞系急性淋巴白血病(B-ALL)和彌漫大B細(xì)胞系淋巴瘤(DLBCL)，這成為細(xì)胞免疫治療的里程碑，顯示出CAR-T細(xì)胞治療的巨大應(yīng)用前景[1-2]。CAR-T細(xì)胞的制備流程包括細(xì)胞純化和分離、活化和分化、基因修飾、體外擴(kuò)增、表型質(zhì)控、保存和回輸。制定合理的制備方法和發(fā)展高效的檢測(cè)技術(shù)是目前CAR-T細(xì)胞治療快速發(fā)展和進(jìn)入臨床應(yīng)用所面臨的重大挑戰(zhàn)。

　　流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry，F(xiàn)CM)是一種能夠?qū)�單個(gè)細(xì)胞或生物微顆粒的生物學(xué)性質(zhì)進(jìn)行定量分析和分選的檢測(cè)手段，具有高效、快速、精準(zhǔn)、多參數(shù)和高通量等優(yōu)點(diǎn)，是目前先進(jìn)的細(xì)胞定性和定量分析技術(shù)之一[3-4]。近年來(lái)，F(xiàn)CM迅速發(fā)展，新技術(shù)不斷突破，新儀器不斷涌現(xiàn)，F(xiàn)CM基于其獨(dú)特的細(xì)胞分選原理和強(qiáng)大的熒光標(biāo)記技術(shù)，在CAR-T細(xì)胞治療過(guò)程表現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢(shì)。

　　本文主要討論了FCM在CAR-T細(xì)胞治療前檢查、輸注后檢測(cè)和各制備環(huán)節(jié)的應(yīng)用與優(yōu)化，以期合成安全高效的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品。治療前檢查CAR-T細(xì)胞治療成功的關(guān)鍵在于準(zhǔn)確評(píng)估患者腫瘤細(xì)胞是否表達(dá)靶抗原及靶抗原的表達(dá)量。Pan等[5]利用第二代靶向CD19的CAR-T細(xì)胞治療42例難治/復(fù)發(fā)性(R/R)B-ALL和9例FCM-MRD+的B-ALL，要求入組病患的腫瘤細(xì)胞利用FCM檢測(cè)必須有顯著的CD19表達(dá)，90%的R/RB-ALL患者實(shí)現(xiàn)完全緩解(CR)，100%FCM-MRD+患者實(shí)現(xiàn)MRD-。B細(xì)胞成熟抗原(BCMA)只表達(dá)于正常和惡性漿細(xì)胞，而靶向BCMA的CAR-T細(xì)胞可用于治療漿細(xì)胞瘤。

　　Salem等[6]利用FCM和免疫組織化學(xué)檢測(cè)同時(shí)評(píng)估了43例漿細(xì)胞瘤患者腫瘤細(xì)胞表面BCMA的表達(dá)情況。結(jié)果表明，F(xiàn)CM檢測(cè)的陽(yáng)性率顯著高于免疫組織化學(xué)檢測(cè)(97%vs72%)(P<0.01)。同時(shí)，F(xiàn)CM可定量細(xì)胞表面BCMA表達(dá)量，區(qū)分正常和異常漿細(xì)胞，使其成為CAR-T細(xì)胞治療前篩查和治療后隨訪的重要工具。T細(xì)胞的獲取和富集CAR-T細(xì)胞批量化生產(chǎn)的初始細(xì)胞群來(lái)源于病人經(jīng)過(guò)血細(xì)胞分離器采集濃縮的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMNC)。

　　然而，富含淋巴細(xì)胞的PBMNC也包括單核細(xì)胞、數(shù)量不等的紅細(xì)胞、粒細(xì)胞和血小板[7]。儀器設(shè)備的發(fā)展促進(jìn)了PBMC的有效分離，例如CliniMACSPlus細(xì)胞分選儀可富集不同T細(xì)胞亞群，如CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞[8]。CD3/CD28磁珠的磁性分選也可以從PBMC濃縮物富集T細(xì)胞，還能刺激T細(xì)胞體外擴(kuò)增[9]。流式細(xì)胞分選術(shù)又稱熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(fluorescenceactivatedcellsorting，F(xiàn)ACS)，能在短時(shí)間內(nèi)高效快速分選成千上萬(wàn)個(gè)目標(biāo)細(xì)胞，目前FACS已廣泛應(yīng)用于T細(xì)胞的分離和富集[10]。

　　來(lái)自于CD3+T細(xì)胞亞群的CAR-T細(xì)胞被廣泛應(yīng)用于臨床[11-12]。有研究表明，低分化階段的干細(xì)胞記憶T細(xì)胞(Tscm)和中央記憶T細(xì)胞(Tcm)能促進(jìn)CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)持續(xù)增殖和長(zhǎng)期存活，相比于高分化階段的效應(yīng)記憶T細(xì)胞(Tem)和快速效應(yīng)T細(xì)胞(Teff)表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗腫瘤活性[13]。有一項(xiàng)臨床試驗(yàn)證明了Tcm來(lái)源的靶向CD19的CAR-T細(xì)胞在治療自體造血干細(xì)胞移植后復(fù)發(fā)的高危淋巴瘤患者中的安全性和可行性，表現(xiàn)出較好的臨床療效，且未觀察到細(xì)胞因子釋放綜合癥(CRS)等副反應(yīng)[14]。CD62L、CCR7、CD45RA、CD45RO是CD8+T細(xì)胞不同分化階段的表面標(biāo)記，利用FCM選擇性富集具有高度自我更新潛能的Tscm和Tscm亞群，可顯著提高CAR-T細(xì)胞治療的療效[15]。

　　T細(xì)胞活化和體外擴(kuò)增目前，已有多種T細(xì)胞活化策略成功應(yīng)用于臨床級(jí)別CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的生產(chǎn)，包括與天然或人造抗原呈遞細(xì)胞共培養(yǎng)[16]、可溶性抗CD3單克隆抗體(OKT3)聯(lián)合IL-2[11,17]、OKT3聯(lián)合CD28抗體共刺激[12,18]、Expamer技術(shù)[19]等。最新的研究指出，在臨床前腫瘤模型中，OKT3/CD28抗體磁珠刺激活化的T細(xì)胞具有相對(duì)低分化的表型，優(yōu)于OKT3聯(lián)合IL-2，因此廣泛應(yīng)用于靶向CD19的CAR-T細(xì)胞[20]。

　　FCM是分析T細(xì)胞活化和增殖的有力工具，利用特異性熒光素偶聯(lián)抗體或特異性熒光探針進(jìn)行復(fù)雜表型分析，評(píng)估T細(xì)胞活化、增生、效應(yīng)因子的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。Reed等[21]討論了利用FCM評(píng)估多種外源因子對(duì)T細(xì)胞活化、增殖、細(xì)胞因子產(chǎn)生和轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)影響的試驗(yàn)方法。熒光素偶聯(lián)抗體既可以靶向表面抗原，也可以靶向胞內(nèi)標(biāo)記蛋白。特異性熒光探針可以用來(lái)分析包括增殖及細(xì)胞周期中DNA含量變化等在內(nèi)的多種細(xì)胞過(guò)程。T細(xì)胞表型質(zhì)控由于CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的復(fù)雜性，在應(yīng)用于臨床之前，必須進(jìn)行嚴(yán)格的T細(xì)胞表型質(zhì)控和放行試驗(yàn)使其達(dá)到明確的放行標(biāo)準(zhǔn)，包括細(xì)胞產(chǎn)品的特性、純度、安全性和效能[8]。

　　細(xì)胞特性試驗(yàn)必須保證批量生產(chǎn)的細(xì)胞產(chǎn)品是目標(biāo)亞群細(xì)胞，目前主要通過(guò)FCM分析細(xì)胞表面特異性的標(biāo)記蛋白來(lái)鑒定，細(xì)胞增殖和分化能力測(cè)定也是常規(guī)應(yīng)用的評(píng)估項(xiàng)目。多種方法可以測(cè)定細(xì)胞增殖能力，如MTT試驗(yàn)、ATP定量、BrdU染色、基于IP/CFSE的流式細(xì)胞術(shù)分析等，其中FCM最為方便準(zhǔn)確[22]。細(xì)胞分化能力主要取決于T細(xì)胞的分化階段，不同分化階段表達(dá)特定表面標(biāo)記物，如CD25、CD45RO、CD45RA、CCR7、CD62L等，利用FCM測(cè)定特定分化階段細(xì)胞比例可鑒定細(xì)胞產(chǎn)品的分化潛能[15]。

　　細(xì)胞純度分析主要用來(lái)檢查表達(dá)抗CAR的CD3+T細(xì)胞比例。FCM是目前臨床上檢測(cè)CAR-T細(xì)胞純度的主要方法。Pan等[23]利用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法構(gòu)建了SFGαCD19.4-1BB-ζ第二代CAR-T細(xì)胞，利用FCM檢測(cè)表達(dá)CAR的細(xì)胞比例在50%以上。細(xì)胞安全性分析必須保證細(xì)胞產(chǎn)品的無(wú)菌性，同時(shí)不含內(nèi)毒素和生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的其他有害物質(zhì)，另一方面還要預(yù)防轉(zhuǎn)基因整合導(dǎo)致的基因毒性。

　　細(xì)胞效能分析主要測(cè)定細(xì)胞產(chǎn)品的靶生物學(xué)活性。體外實(shí)驗(yàn)主要測(cè)定CAR-T細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的直接殺傷作用和細(xì)胞因子的分泌情況。體外細(xì)胞毒試驗(yàn)包括51Cr釋放試驗(yàn)[24]、LDH試驗(yàn)[25]、基于重要生物靶標(biāo)的FCM[26]、熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)[27]以及ELISpot分析[28]等。應(yīng)用FCM檢測(cè)粘附腫瘤細(xì)胞系相關(guān)參數(shù)一直是個(gè)挑戰(zhàn)。Martinez等[29]利用高通量流式細(xì)胞術(shù)探究了CAR-T細(xì)胞對(duì)多種粘附腫瘤細(xì)胞的T細(xì)胞依賴性的細(xì)胞殺傷作用，并探討了最佳實(shí)驗(yàn)條件，表明高通量FCM在體外測(cè)定CAR-T細(xì)胞對(duì)實(shí)體腫瘤細(xì)胞毒作用的可行性。

　　近年來(lái)發(fā)展的流式微珠陣列技術(shù)(cytometricbeadarray，CBA)可同時(shí)測(cè)定多種細(xì)胞因子含量，相比于ELISA，CBA具有樣本用量更少、檢驗(yàn)迅速、多指標(biāo)檢測(cè)、操作方便、靈敏度高、重復(fù)性好、無(wú)酶-底物干擾的優(yōu)勢(shì)[30]。研究者曾用CBA技術(shù)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)唾液中IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ水平，靈敏度可達(dá)0.274pg/ml[31]。輸注后監(jiān)測(cè)患者回輸CAR-T細(xì)胞后需定期檢測(cè)體內(nèi)CAR-T細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞因子水平、患者腫瘤負(fù)荷和毒副反應(yīng)，便于綜合評(píng)價(jià)CAR-T細(xì)胞的治療療效和臨床獲益情況。有臨床試驗(yàn)表明，CAR-T細(xì)胞輸注后的擴(kuò)增能力和存活時(shí)間是其有效殺傷腫瘤細(xì)胞的主要影響因素[32]。定位到骨髓的CAR-T細(xì)胞可擴(kuò)增1000倍以上，上升趨勢(shì)可維持6個(gè)月[33]。

　　監(jiān)測(cè)患者外周血CAR-T細(xì)胞數(shù)量可有效預(yù)測(cè)細(xì)胞免疫治療反應(yīng)。目前，CAR-T細(xì)胞監(jiān)測(cè)方法主要有FCM[34-35]、定量PCR技術(shù)[36]和示蹤劑PET/SPECT成像[37]，其中FCM和定量PCR技術(shù)在臨床上使用較普遍。FCM利用特異性熒光標(biāo)記的抗體可以靶向胞外區(qū)分子、抗原結(jié)合域或融合蛋白，然而利用不同抗體檢測(cè)的FCM容易導(dǎo)致結(jié)果的異致性[34]。有一項(xiàng)研究建立了基于熒光標(biāo)記蛋白L的FACS檢測(cè)CAR表達(dá)的方法，利用6種靶向不同CAR結(jié)構(gòu)域的抗體，比較了人和小鼠來(lái)源CAR結(jié)構(gòu)域的差異，結(jié)果表現(xiàn)出一致性[35]。

　　白血病患者腫瘤負(fù)荷主要定期評(píng)價(jià)骨髓細(xì)胞學(xué)和微小殘留病(MRD)，淋巴瘤患者主要復(fù)查PET/CT。MRD是用來(lái)描述基于傳統(tǒng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)不能檢測(cè)到的最小腫瘤負(fù)荷，是臨床上廣泛用來(lái)評(píng)價(jià)療效和評(píng)估預(yù)后的重要指標(biāo)[38]。MRD定量檢測(cè)包括基于識(shí)別白血病相關(guān)異常免疫表型(LAIPs)的多色流式細(xì)胞術(shù)和檢測(cè)白血病特異性IG/TR基因重排或融合基因的實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)(RTqPCR)[39]。雖然RT-qPCR是目前靈敏度最高的MRD檢測(cè)方法，但部分白血病患者缺乏供PCR檢測(cè)的遺傳學(xué)標(biāo)記，此時(shí)FCM是唯一選擇。FCM作為一種快速便宜的MRD檢測(cè)方法，應(yīng)用于90%ALL患者M(jìn)RD的檢測(cè)，靈敏度達(dá)104[40]。

　　展望細(xì)胞治療為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和健康體系帶來(lái)了革命性變化，但是將CAR-T細(xì)胞批量化生產(chǎn)為臨床用藥仍面臨許多挑戰(zhàn)，需要多學(xué)科的密切交叉合作。近年來(lái)，流式細(xì)胞儀器不斷升級(jí)、流式細(xì)胞技術(shù)不斷發(fā)展，使FCM的應(yīng)用范圍大大的擴(kuò)展。流式細(xì)胞術(shù)不僅在CAR-T細(xì)胞制備的初始T細(xì)胞獲取和富集、體外激活和擴(kuò)增、表型質(zhì)控和釋放試驗(yàn)等多個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行優(yōu)化，也在治療前患者篩查和回輸后體內(nèi)監(jiān)測(cè)、MRD檢測(cè)方面也發(fā)揮著重要作用。實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展、儀器設(shè)備的改善、多學(xué)科合作將加速CAR-T細(xì)胞研發(fā)進(jìn)展，使CAR-T細(xì)胞早日商品化，應(yīng)用于臨床。

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　　作者：李成功1,2，梅恒1,2*，胡豫1,2