摘要：次生代謝產物是藥用植物的重要有效成分，但由于野生資源日益減少和栽培品種品質退化，給臨床使用和質量控制帶來許多困擾，利用組織培養技術生產有效成分，能緩解藥用植物資源壓力。本文總結了在植物組織培養過程中，外植體的選擇、培養條件、培養方法等因素對次生代謝產物積累的影響，并簡述了應用誘導子、添加前體物、添加抑制劑和應用基因工程技術四種促進次生代謝產物積累的方法，旨在為利用組織培養技術生產次生代謝產物提供理論參考，為藥用植物資源的開發和利用提供科學指導。

　　關鍵詞：藥用植物;組織培養;次生代謝產物

　　引 言

　　隨著經濟的發展、人們對健康需求的提高以及人口進一步老齡化，中藥資源的需求量不斷提高。目前藥用植物主要以人工栽培方式進行生產，相比于農作物，大多數藥材的生產周期較長，有限的土地資源也限制了藥材種植面積的擴大。傳統的栽培方式難以滿足中藥資源不斷增長的需求，同時中藥資源需求的不斷提高給野生中藥資源的保護帶來了極大的壓力，部分野生中藥資源因遭受濫采濫伐而瀕臨滅絕。采用藥用植物組織培養的生產方式，可在有限時間與空間內生產藥用植物次生代謝產物，有效解決中藥資源的供需矛盾，實現中藥資源的有效保護與合理利用。本文綜述了藥用植物組織培養生產次生代謝產物的研究進展，為通過組織培養技術生產次生代謝產物提供科學指導。

　　1 利用組織培養生產藥用

　　植物次生代謝產物的優點組織培養技術是在人為創造的無菌條件下，將活的離體器官(如根、莖、葉、莖段、原生質體)、組織或細胞置于培養基內，并放在適宜的環境中不斷培養，以獲得細胞、組織或個體的技術[1]。植物代謝過程中產生的各種次生代謝物，在傳統醫藥和食品領域起著重要作用，主要用于醫藥、食品添加劑和工業產品的生產。傳統的栽培方法是通過種子繁殖和扦插等方式獲得優良的藥用植物品種，該方法耗時長，成 本 高 ，通 常 次 生 代 謝 產 物 含 量 低 ，難 以 大 量 生產[2]。

　　而植物組織、細胞和器官培養技術可在離體培養的微環境中控制植物成分的生長和生產。這個過程可以通過調節各種生長參數和因素來實現，從而使生產最優化，不受地理或季節變化的影響，降低了生產成本。據統計，近 1 000 種藥用植物的離體培養技術獲得了成功，提供了 600 多種次生代謝產物，其中有些藥用植物次生代謝產物含量大于或等于原植物的含量，并且人參皂苷、紫杉醇、青蒿素等的離體培養生產已經達到了工業化水平[3]。目前，為了大量地生產次級代謝產物，細胞、不定根、毛狀根已經成功地應用于大規模培養。例如 ，人參(Panaxginseng)不定根培養已經達到 30 000 L，金絲桃(Hy⁃pericum aviculariifolium)不定根已經達到 500 L，紫錐 菊(Echinacea purpurea)不 定 根 已 經 達 到 1 000L[4]。

　　韓國 CBN 生物科技公司，每年生產 40~45 噸人參不定根，這是一個利用植物組織培養生產藥品、食品和化妝品的成功范例[5]。中國普瑞康生物技術有限公司通過植物細胞技術已經篩選出頂級的天山雪蓮(Saussurea involucrata)培養物，實現雪蓮培養物的工業化生產，年產量達 5 000 公斤。運用植物組織培養技術規模化合成中藥重要活性物質，解決天然中藥材來源與提高藥用成分含量，屬于生物醫藥中的中藥現代化領域，其產品不僅可廣泛用于醫藥、食品、化妝品、護理品，還有助于解決中藥資源的可持續標準化供應問題;帶動相關制藥工業和制藥裝備工業的發展;有利于維護生態平衡，保護自然環境;避免人工種植中藥材的物種退化;同時符合國家戰略規劃，有助于實現中藥材產業現代化。

　　2 影響藥用植物組織培養生產次生代謝產物的因素

　　2. 1 外植體的選擇

　　能夠發生次生代謝的細胞株往往來自適當生理狀態下的外植體[6]。通常，不同植物或器官所含有的次生代謝產物的含量和種類不同。一般由次生代謝活動旺盛的植物或器官誘導出的愈傷組織中的次生代謝產物含量較高[7]。對從野生葡萄(Vitis vinif⁃era)不同器官培養獲得的愈傷組織細胞培養物進行研究，結果發現莖誘導的愈傷組織中苯丙氨酸解氨酶和苯乙烯合成酶基因表達量比葉和葉柄誘導的愈傷組織中的要高[8]。有研究學者對姜黃(Curcumalonga)進行研究，分別用葉鞘、葉片、葉基部、頂端芽和側芽誘導培養愈傷組織，6 次繼代培養后，以側芽為外植體的愈傷組織中姜黃素和總酚的含量明顯高于 其 他 愈 傷 組 織[9]。

　　用 荷 包 牡 丹(Lamprocapnosspectabilis)的葉片、葉柄和節間外植體進行愈傷組織誘導，發現外植體類型對愈傷組織中花青素和多酚有顯著影響，葉柄愈傷組織和節間愈傷組織的花青素含量和多酚含量高于全葉愈傷組織的花青素含量和多酚含量[10]。有研究表明，與由花誘導的愈傷組織相比，由薔薇(Rosa gallica)葉片和莖誘導的愈傷組織的花青素和葉綠素產量最高[11]。有研究表明外植體類型會影響鳳仙花(Impatiens balsamina)根培養物中的萘醌產量，由葉外植體培養產生的萘醌總量高于由根外植體培養產生的萘醌總量[12]。因此，利用植物組織培養技術生產次生代謝物時，選擇生長快速且具有較高次生代謝物合成能力的外植體非常重要。

　　2. 2 培養基的成分

　　2. 2. 1 碳源糖在培養基中的類型和濃度是影響次生代謝產物生物合成的重要因素。植物組織培養通常使用葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖等作為能量和碳源進行異養生長。相比于果糖和葡萄糖，蔗糖被發現是誘導馬來沉香(Aquilaria malaccensis)愈傷組織產生最高生物量的最有效碳源;濃度為 15 g/L 的蔗糖顯著誘導愈傷組織增殖，產生的生物量高于葡萄糖的 1. 2倍 ，高 于 果 糖 的 2 倍[13]。 研 究 蔗 糖 濃 度 對 三 七(Panax notoginseng)不定根培養過程中三種人參皂苷(Rg1、Re 和 Rb1)積累的影響，結果發現在 30 g/L蔗糖處理下，三種人參皂苷含量最高[14]。苦艾(Ar⁃temisia absinthium)細胞懸浮培養中，在最大生物量和次生代謝產物積累方面，雙糖(蔗糖和麥芽糖)處理優于單糖(果糖和葡萄糖)處理;在蔗糖和麥芽糖處理下，生物量最大，總酚和總黃酮生物合成含量最高[15]。有研究發現，當蔗糖濃度高于 5% 時，可抑制刺參(Oplopanax elatus Nakai)不定根中酚類化合物的積累，這表明高濃度蔗糖引起的高滲透脅迫對刺參體內總酚的積累產生了不利影響[16]。

　　用不同濃度的 蔗 糖 對 龍 葵(Solanum nigrum)愈 傷 組 織 進 行 培養，發現隨著培養基中蔗糖含量的增加，愈傷組織中龍葵堿含量顯著增加[17]。用不同濃度的蔗糖對夏枯草(Prunella vulgaris)懸浮細胞分別進行培養，結果發現在 20~25 g/L 蔗糖處理下，生物量、酚類物質、黃酮類物質、蛋白質含量和抗氧化活性均達到最大值[18]。用不同水平的果糖、半乳糖、葡萄糖和蔗糖為碳源培養山莨菪(Anisodus acutangulus)毛狀根時，發現用蔗糖含量為 3% 的培養基培養的毛狀根生物堿含量最高[19]。從上述可知，植物的生長和次生代謝物合成與碳源有關，要促進次生代謝產物積累，碳源的組成和濃度都是要考慮的重要影響因素。

　　2. 2. 2 氮源氮源是植物正常生長的必要條件，不同 NH4+/NO3- 比值的氮源對植物的生長和代謝有顯著的影響，且單獨以硝酸鹽或銨鹽為氮源，都不利于植物的生長和代謝。Irshad 等[20]分析了 MS 培養基中不同濃度的總氮對野生秋葵(Abelmoschus esculentus)愈傷組織中花青素的影響，發現在中氮水平培養基中，花青素積累增強，而高氮水平和低氮水平培養基中，花青素產量下降。在金鐵鎖(Psammosilene tunicoi⁃des)毛狀根懸浮培養中，當培養基中 NH4+ 與 NO3-的濃度比為 1∶2 時，毛狀根生物量和總皂苷的收獲量都達到最高值[21]。研究發現，硝態氮和銨態氮比例為 5∶1 時，甘草(Glycyrrhiza uralensis)細胞獲最大生 物 量 ，以 銨 態 氮 為 氮 源 ，黃 酮 類 物 質 積 累 量 最高[22]。

　　為優化雷公藤(Tripterygium wilfordii)毛狀根的生物量和生產雷公藤堿乙和雷公藤次堿的培養基，研究表明，10∶50(NH4+/NO3-)處理的毛狀根生物量最大，雷公藤堿乙和雷公藤次堿產量最大;雖然在 50∶10(NH4+/NO3-)濃度處理下，雷公藤堿乙和雷公藤次堿的含量最高，但是 50∶10(NH4+/NO3-)的生物量顯著低于 10∶50(NH4+/NO3-)處理的生物量，導致雷公藤堿乙和雷公藤次堿的產量顯著低于10∶50(NH4+/NO3-)處理的;從而得出 10∶50(NH4+/NO3-)對 雷 公 藤 毛 狀 根 生 長 和 生 物 堿 積 累 最 適宜[23]。

　　研究氮對甜葉菊(Stevia rebaudiana)次生代謝產物的影響，結果表明，高水平的氮導致萊鮑迪糖苷 A 的含量減少，在 2. 5~3. 5 倍氮培養基上生長的植株的萊鮑迪苷 A 水平顯著降低，這與培養基中的氮供應呈負相關[24];對照組中萊鮑迪甙 A 和甜菊糖苷含量均最高;然而，甜菊糖醇含量被發現與生長培養基中氮水平的增加呈正相關。從這些研究可知，選擇合適的氮源有利于次生代謝產物的積累。

　　2. 2. 3 磷源磷源是一種重要的營養物質，參與代謝產物的形成、能量代謝和生物合成。將甘草不定根接種于添加不同濃度磷酸鹽的 1/2 MS 培養基中培養[25]，結果 表 明 ，在 1. 25 mmol/L 磷 酸 鹽 處 理 下 ，多 糖(15. 66 mg/g)含量達到最大值;0. 625 mmol/L 磷酸處理的黃酮類化合物(7. 54 mg/g)和甘草酸(0. 57mg/g)積累量最高;甘草次酸(0. 32 mg/g)積累的最適 磷 酸 鹽 濃 度 為 0. 312 5 mmol/L。 在 長 春 花(Catharanthus roseus)細胞懸浮培養中，添加不同水平的磷酸氫二銨和磷酸二氫銨，總氮(NH4++NO3-)和磷酸鹽的增加會促進生物堿生物合成的增強[26]。

　　在太子參(Pseudostellaria heterophylla)不定根培養中，低磷酸鹽濃度有利于生物量的產生，而高磷酸鹽濃度則能顯著提高太子參不定根培養中多糖的含量[27]。在培養西洋參(Panax quinquefolius)毛狀根的 B⁃5 培養基中添加 0. 83 mmol/L 磷酸鹽，6 種人參皂苷(Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re 和 Rg1)的總含量達到最大 值 ，與 對 照 組 相 比 ，人 參 皂 苷 的 含 量 增 加 了20%[28]。在人參的不定根培養中發現，當磷酸鹽濃度為 0. 625 mmol/L 時，根生長率達到峰值，然而當磷酸鹽濃度為 1. 25 mmol/L 時，人參皂苷含量達到最大值[29]。這些結果說明，磷源對次生代謝產物的積累也起著重要的作用，不同植物的次生代謝產物積累所需要的磷濃度不同。

　　2. 3 培養條件

　　2. 3. 1 光照光是直接影響植物發育過程和次生代謝產物生物合成的關鍵誘導子之一。不同的光照強度、光質、光周期會影響藥用植物次生代謝產物的積累。琺菲 亞(Pfaffia glomerata)在 三 種 不 同 比 例 的 紅 色(R)和藍色(B)燈光下體外培養：(i)1R∶1B，(ii)1R∶3B，(iii)3R∶1B;紅光和藍光配比相同(1R∶1B)可增加生物量積累、花青素含量和 20 ⁃羥基蛻皮激素產量(提 高 30%~40%)[30]。 分 別 在 100% 紅 、100%藍 、100% 綠 、RGB(40% 紅∶40% 綠∶20% 藍)和100% 白(對照)光照條件下培養紅景天(Rhodiolaimbricata)愈傷組織，結果表明，與其他光照條件相比，藍光處理愈傷組織培養的紅景天苷、總酚和總黃酮積累量最大[31]。

　　研究不同光譜光對羅勒(Oci⁃mum basilicum)愈傷組織中苯丙烷代謝產物生物合成的影響，與對照組相比，藍光處理下的生物量積累 、總 酚 含 量 、總 黃 酮 含 量 以 及 抗 氧 化 劑 DPPH、FRAP 和 ABTS 的活性最大[32]。分別在光照和黑暗條件下進行紫草(Arnebia euchroma)細胞的懸浮培養，觀察光照對萘醌色素合成的影響，發現在光照條件下，直到培養第 4 天，萘醌色素含量都有所增加，但隨著培養時間的延長，在光照條件下萘醌色素含量降低，而在黑暗條件下萘醌色素含量繼續增加[33]。 用 不 同 的 光 培 養 催 眠 睡 茄(Withania som ⁃nifera)愈傷組織，發現紫光條件有利于愈傷組織中酚類化合物和黃酮類化合物的合成;紅光處理下愈傷組織中生物量積累效果最好，以及綠原酸和醉茄素 A 含量顯著增加[34]。這些研究表明，不同的藥用植物有各自的最佳光照條件，適當調整光照質量和光照量可以提高次生代謝產物的產量。

　　2. 3. 2 溫度藥用植物離體培養溫度一般為 20~28 ℃，通常控制在 25 ℃左右。溫度不僅影響植物生長，還控制產物合成途徑相關酶的活性，從而影響次生代謝產物的積累。在三分三(Anisodus acutangulus)毛狀根培養中，當溫度為 25 ℃時毛狀根的生物量和莨菪堿含量最高，低于 25 ℃和超過 30 ℃時毛狀根生物量和莨菪堿含量顯著下降[35]。山羊豆(Galega officina⁃lis)愈傷組織培養時，用四種不同溫度(4 ℃、22 ℃、35 ℃和 45 ℃)處理后，發現 4 ℃處理下木質素、染料木素、對香豆酸、柚皮苷、芹菜素、反式阿魏酸、水楊酸和蘆丁含量最高[36]。

　　用不同溫度培養人參不定根，結果表明，人參總皂苷在 25 ℃培養時含量最高;此外，研究還表明，低溫刺激可促進人參皂苷的積累，10 ℃環境下處理 7 d，然后轉移到 25 ℃處理 28 d時，人參總皂苷含量較 25 ℃處理增加了 2. 53 倍[37]。在翅萼石斛(Dendrobium cariniferum)體外培養中，當培養溫度為(23±2)℃時，生物量積累最高，然而幼苗的生長消耗了營養，導致生物活性化合物的積累很少;當培養溫度為(25±2)℃時，雖然幼苗生長較慢，但此時多糖和生物堿積累量較其他培養溫度最 高[38]。 研 究 不 同 溫 度 對 水 飛 薊(Silybum maria⁃num)毛狀根培養物生物量和水飛薊素的影響[39]，結果 表 明 ，25 ℃/25 ℃ 培 養 下 毛 狀 根 水 飛 薊 素 產 量(0. 18 mg/g DW)高 于 15 ℃/20 ℃和 30 ℃/25 ℃培養 下 水 飛 薊 素 產 量(分 別 為 0. 13 和 0. 12 mg/gDW)。不同植物的最適溫度不同，因此選擇適宜的溫度對藥用植物次生代謝產物的合成十分重要。

　　2. 3. 3 pH 值培養基的 pH 值對植物生長和次生代謝產物積累有顯著影響。植物生長直接受培養基營養成分的影響，但營養的吸收主要受培養基 pH 的影響。pH的變化會影響培養基成分的狀態，從而影響次生代謝產物的積累。不同植物的高效生長、發育和次生代 謝 產 物 的 產 生 都 需 要 特 定 的 pH 值 。 對 鬼 臼(Podophyllum hexandrum Royle)不 定 根 培 養 進 行了不同 pH 處理的試驗[40]，結果表明，當初始培養基pH 為 6 時，鬼臼不定根培養過程中生物量和鬼臼毒素積累量最高。培養液中不同 pH 對鐵皮石斛(Den⁃drobium candidum)原球莖生物量及有效物質含量有影響，當培養液 pH 為 5. 8 時，原球莖生長最好，且多糖和生物堿生產量達到最高[41]。

　　在睡茄(Witha⁃nia somnifera)細胞培養中，高 pH 和低 pH 培養基都不能刺激生物量和睡茄內酯 A 的產生[42]，但在芽培養中，初始 pH 為 4. 5 的培養基最適合生物量和苦艾素 A 的產生[43]。研究發現在甜葉菊(Stevia rebaudi⁃ana)不定根培養中，較低的 pH 水平(pH=5. 1)促進甜菊糖苷和萊鮑迪苷 A 的合成，但多酚類物質的產量減少;當 pH 為 5. 8 時，杜克苷含量較高[44]。研究pH 對灰氈毛忍冬(Lonicera macranthoids)細胞懸浮培養物產量和綠原酸的影響[45]，發現培養基 pH 為5. 5 和 6. 0 時生物量最高，分別為 6. 52 g/L 和 6. 76g/L，此時綠原酸含量最高。因此，調整 pH 值是提高次生代謝產物含量的一種有效方法。

　　2. 5 培養方法

　　2. 5. 1 兩階段培養

　　兩階段培養法是指第一步主要使用適合細胞生長的培養基即生長培養基，第二步使用適合次級代謝產物積累的培養基即生產培養基。由于細胞生長和次生代謝物產生對培養基和培養條件的要求不同，一般采用兩階段培養法來提高生物量和次生代謝產物。在研究長春花(Catharanthus roseus)搖瓶懸浮液生產吲哚生物堿時，使用兩種方式進行培養，一種方式直接放置于生長培養基中培養，另外一種方式采用兩階段培養技術進行培養，兩種培養體系可產生高達 20 g/L DW 的生物量;但兩階段培養技術產生的細胞活性更高，吲哚生物堿產量比另外一種 培 養 方 式 高 10 倍 ，且 產 物 顯 著 釋 放 到 培 養 基中[51]。

　　研究發現明黨參(Changium smyrnioides)懸浮細胞采用兩階段培養后的第 20 d，生物量的積累達到最大值，比只使用 MS 培養基的細胞數目提高了 12. 6%，第 24 d 總 香 豆 素 積 累 量 達 到 最 大 值0. 288 2 mg/L，比 只 使 用 White 培 養 基 的 提 高 了60. 7%，細 胞 中 佛 手 酚 、佛 手 柑 內 酯 含 量 達 到 了1. 79%、0. 36%，比 一 步 法 提 高 了 1. 75 倍 和2. 86%[52] 。 采 用 兩 階 段 培 養 體 系 進 行 巴 戟 天(Morinda coreia)不定根培養，首先在添加 1. 0 mg/L IBA 的液體培養基中增殖巴戟天不定根，然后把這些不定根轉到兩階段培養體系，在不含 IBA 的液體培養基中培養，結果發現，蒽醌類化合物的產量是體內培養的 4. 09 倍[53]。兩階段培養法使細胞生長和代謝均能在適合的條件下進行，較好地解決了細胞生物量增殖與次生代謝產物積累之間的矛盾，是促進次生代謝產物合成的一種較好的方法。

　　2. 5. 2 兩相培養

　　兩相培養技術是在培養體系中加入水溶性或脂溶性的有機物或者具有吸附作用的多聚化合物，使培養體系形成上、下兩相;細胞在水相中生長，合成的次生代謝物質分泌出來后轉移至有機相中。由于植物次生代謝產物在培養的植物細胞中合成和儲存的位置不同，在細胞培養中的次生代謝產物含量低可能是由于反饋抑制、在培養基中合成產物被酶或非酶降解或可能產生的代謝物具有揮發性。因此，在液體培養基中添加液體或第二固相的人工堆積生產位點可以提高凈生產率[54]。

　　兩相共培養利用分配系統將培養基中的分泌產物重新分配到第二個非極性階段，有效避免反饋抑制效應，在細胞、組織或器官培養生產次生代謝產物方面具有重要應用價值。采用兩相培養法進行夏雪片蓮(Leucojum aestivum)芽培養，胞內加蘭他敏積累量是對照的 1. 7 倍，胞外加蘭他敏積累量是對照的 1. 9 倍[55]。采用固液兩相培養技術對紫草(Arnebia euchroma)細胞進行了培養，其中固相為聚氨酯泡沫，實驗中加入聚氨酯泡沫后紫草色素的合成及分泌提高了 3 倍多[56]。以雷公藤(Tripterygium wilfordii)不定根為材料，通過兩相培養技術，研究有機溶劑鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)不同濃度及培養時間對雷公藤不定根生長及次生代謝產物含量的影響，結果顯示，DBP 濃度為 6%、培養至第 6 d 時，不定根增長量為對照的 1. 06 倍;DBP濃度為 2%、培養至第 8 d 時，內酯醇含量達 74. 96μg/g，為對照組(53. 67 μg/g)的 1. 40 倍[57]。

　　3 調控藥用植物組織培養生產次生代謝產物的途徑

　　3. 1 誘導子的應用植物

　　次生代謝產物是植物細胞在體內生長過程中對環境干擾的反應而產生的，是對入侵病原菌誘導子的防御反應。因此，越來越多人使用化合物來觸發培養的植物細胞、組織或器官的防御反應，以提高體外培養中生物活性化合物的產量。這些誘導子可以是生物或非生物的，可能包括信號分子(如茉莉酸甲酯、水楊酸)、微生物細胞壁提取物(如酵母提取物、殼聚糖)、無機鹽、重金屬甚至物理制劑(如紫外線輻射)等[59]。這為提高植物體外培養產量提供了另一種途徑，并在許多細胞、組織和器官培養系統中取得了成功。在西洋參(Panax quinquefolius)懸浮培養中，使用一種非生物誘導子硝酸鈷，使人參皂苷產量比對照增加兩倍[60]。

　　研究生物誘導子粉紅粘帚霉發酵液、茉莉酸甲酯和冠菌素對桃兒七(Sinopodo⁃phyllum hexandrum)不定根鬼臼毒素積累的影響[61]，結果表明，粉紅粘帚霉發酵液、茉莉酸甲酯和冠菌素都能顯著地促進不定根鬼臼毒素的積累。在八角蓮(Dysosma versipellis)離體培養中使用真菌誘導子，經過 3 周的培養，內生真菌誘導子能提高八角蓮離體根中鬼臼毒素的含量[62]。在瓜葉栝樓(Trichosanthescucumerina)細胞懸浮培養中，用 200 µmol/L 的茉莉酸甲酯誘導子處理 6 d 后可以生產更多的瀉根醇酸，約為相應的對照組的兩倍;而用 1 mg/mL 的殼聚糖誘導子處理 8 d后瀉根醇酸水平增加到幾乎比對照組高 出 兩 倍 的 水 平[63]。 對 蛇 根 草(Ophiorrhiza mun⁃gos)進行懸浮培養時，當用酵母提取物和硝酸銀作為誘導劑時，喜樹堿的產量分別增加了 13. 3 倍和 8. 7倍[64]。可見使用適宜的誘導子對植物次生代謝產物的合成有一定的促進作用。

　　3. 2 添加前體物

　　提高體外次級代謝產物產量的一個重要障礙是初級底物水平低，這可以通過前體飼喂來解決。外源應用前體物可以提高次生代謝產物的合成，基于這一理念：任何在次生代謝產物生物合成途徑中是起始物或中間體的化合物，都有望促進次生代謝產物的合成[65]。研究發現，投喂石蒜科生物堿前體 4'⁃O⁃甲基降孤挺花啶顯著提高了水仙(Narcissus tazet⁃ta)鱗莖中加蘭他敏和石蒜堿的積累[66]。有研究發現 L⁃酪氨酸會影響菜豆(Phaseolus vulgaris)愈傷組織中 L⁃DOPA 的積累，在所有測試濃度下，L⁃酪氨酸從第 3 天到第 12 天都提高了 L⁃DOPA 的含量;到第 12 天，L ⁃DOPA 濃度達到最大值 200 mg/L，增加了 17. 75 倍;結果表明，L⁃酪氨酸可作為合成 L⁃DO ⁃PA 的天然有效前體[67]。

　　在北美圓柏(Juniperus vir⁃giniana)愈傷組織和懸浮培養中添加前體物苯丙氨酸，愈傷組織在添加 10 mmol/L 苯丙氨酸處理 21 d后，對鬼臼毒素的產量影響最大，鬼臼毒素的含量為0. 15 mg/g DW，比對照高 400% 左右;新衍生的懸浮培養物(第 4 代)在添加 1 mmol/L 苯丙氨酸后，鬼臼毒素在 14 d 后含量最高(0. 48 mg/g DW)，這比對照高出 243%[68]。在積雪草(Centella asiatica)毛狀根培養中，分別使用不同濃度的角鯊烯和丙酮酸前體物，發現角鯊烯和丙酮酸前體物能促進積雪草毛狀根三萜類化合物的積累[69]。為提高肉桂三萜的含量，將角鯊烯、膽固醇和甾體酚等外源性甾醇飼喂肉桂(Cinnamomum cassia)的培養物，發現高劑量的甾體酚飼喂可促進三萜的產量增加[70]。這些研究表明，添加前體物對次生代謝產物的合成具有積極的促進作用。

　　3. 3 添加抑制劑添加代謝抑制劑

　　可抑制旁路代謝和切斷其他非目標代謝物的合成途徑，改變細胞中代謝物的方向，從而促進目標化合物的合成。在紅豆杉(Taxuscuspidata)懸浮細胞培養中，分別添加洛伐它汀(甲羥戊酸途徑抑制劑)和磷甘霉素(非甲羥戊酸途徑抑制劑)進行處理，發現兩種抑制劑對紫杉醇的積累都有促進作用，而磷甘霉素作用較大[71]。在東北紅豆杉(Taxus cuspidata)懸浮細胞培養中，分別添加赤霉素和肉桂酸代謝抑制劑，發現兩種代謝抑制劑對紫杉醇的生物合成都有促進作用，隨著濃度的增加，紫杉醇單位產量先增加，然后達到最大值，然后略有下降，這是由于抑制了與紫杉醇合成無關的分支途徑，所以反應傾向于紫杉醇合成的方向[72]。

　　在海南粗榧(Cephalotaxus mannii)懸浮培養第 15 日，添加30 mg/L 丙氨酸(糖酵解途徑中重要的限速酶丙酮酸激酶的抑制劑)時，對海南粗榧三尖杉酯堿和高三尖杉酯堿的積累都有一定的促進作用，產物含量最高，為對照組的 1. 7 倍[73]。在嘉蘭(Gloriosa super⁃ba)細胞懸浮培養中，分別添加不同劑量的乙烯抑制劑 AgNO3，AgNO3處理的細胞懸浮培養物在培養 15天和 30 天內，秋水仙堿和硫秋水仙苷生物合成含量均有所提高[74]。可見使用抑制劑是提高次生代謝產物含量的一種有效手段。

　　4 展 望

　　近幾十年來，藥用植物離體培養技術發展迅速，成為解決珍稀藥用植物資源短缺的有效手段。但是很多藥用植物組織和細胞的次生代謝產物含量少于原植物，沒有達到預期的目的，而且成本較高。展望未來，藥用植物次生代謝產物的生產要想實現工業化發展，應從以下幾個方面著手：(1)闡明特定生產策略中涉及的信號轉導途徑，以提高生物量和分子的生物合成;(2)調控生產的控制因素和機制，包括基因操作以提高生產;(3)克隆參與生物合成的基因及其修飾設計目標分子的代謝通量;(4)分析代謝通量和中間體，以了解它們的生物合成途徑和調控。隨著科學技術的進一步發展，相信在不久的將來，藥用植物次生代謝產物的工業化生產體系會變得更加成 熟 ，為人 們 的 健 康 和 治 療 疾 病 提 供 豐 富 的 原 料資源。

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　　作者：范沾濤 1，2，3，韋 范 1，2，喬 柱 1，2，梁 瑩 1，2，謝唐貴 1，劉吉華 3 *，韋坤華