[摘要] 目的：通過整合分析甘草抗炎活性與性狀特征數(shù)據(jù)，研究感官評價的科學(xué)性。方法：基于核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白 3(NLRP3)炎癥小體細(xì)胞模型，建立甘草的抗炎生物效價測定方法，通過測定生物效價將采集的甘草樣品分級。通過電子鼻、色彩色差儀等方法采集不同等級甘草樣品的性狀信息，通過主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘法(OPLS-DA)分析不同等級甘草的差異性，并進(jìn)一步考察性狀特征與甘草抗炎活性關(guān)聯(lián)性。結(jié)果：實驗結(jié)果顯示甘草提取物對尼日利亞菌素誘導(dǎo)的小鼠原代骨髓巨噬細(xì)胞 NLRP3 炎癥小體的激活具有明顯抑制作用，根據(jù)甘草的抗炎生物效價，可將 10 批次甘草分為兩個等級，一等甘草的生物效價在 5.949~11.418U·mg–1 之間，二等甘草的生物效價在 1.575~1.887 U·mg–1 之間;PCA 結(jié)果顯示兩等級甘草可以聚成兩類;OPLSDA 結(jié)果顯示 R2X=0.534，R2Y=0.863，Q2=0.75，模型的擬合能力較好，預(yù)測能力較強，并且發(fā)現(xiàn)色度值 b*和斷面直徑 2R 的 VIP 值分別為 1.542 94、1.260 11，均大于 1，兩者可能是導(dǎo)致兩等級甘草藥效差異的關(guān)鍵參數(shù)，經(jīng)過實測值比較，兩等級甘草在 b*上存在顯著性差異。結(jié)論：研究表明，甘草的色度值 b*與甘草抗炎活性具有顯著的相關(guān)性，是其質(zhì)量評價的一個重要指標(biāo)，也佐證了甘草傳統(tǒng)評價具有一定的科學(xué)性。

　　[關(guān)鍵詞] 甘草;感官評價;核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白 3;炎癥小體;主成分分析;正交偏最小二乘法

　　甘草來源于豆科植物甘草 Glycyrrhiza uralensis Fisch.、脹果甘草 G. inflata Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根及根莖[1]，是中藥大品種之一，在中藥應(yīng)用中具有十分重要的地位，被譽為中藥中的“國老”。甘草質(zhì)量是其臨床療效的保證。感官評價是甘草質(zhì)量評價的一種重要方法，主要是根據(jù)藥材的形、色、氣味、斷面等性狀信息來判斷質(zhì)量的優(yōu)劣，這種質(zhì)量評價方法來源于古代臨床應(yīng)用的總結(jié)，具有直觀簡便[2]等優(yōu)勢。

　　但是由于這種傳統(tǒng)的評價方法存在主觀性較強等問題，其是否還適用于現(xiàn)代的甘草質(zhì)量評價，能否準(zhǔn)確反映其臨床活性的差異性有待進(jìn)一步探討。甘草調(diào)和諸藥，在臨床上應(yīng)用廣泛，具有抗炎、保肝、調(diào)節(jié)免疫等多種藥理活性[3]。現(xiàn)代研究表明，多種疾病的發(fā)生和發(fā)展都伴隨著炎癥的產(chǎn)生[3-6]，抑制炎癥反應(yīng)是甘草發(fā)揮多種藥效作用的共性特征。因此，抗炎可能是甘草質(zhì)量評價的一個重要指標(biāo)。炎癥小體是炎癥反應(yīng)的重要組成部分，與眾多炎癥性疾病以及免疫性疾病密切相關(guān)，包括黑素瘤缺乏因子 2(AIM2)、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白 3(NLRP3)、NLR 家族 CARD 結(jié)構(gòu)域包含蛋白 4(NLRC4)等[7]。

　　NLRP3 炎癥小體是它們中最具有特點的一種，能夠被多種刺激劑(如尼日利亞菌素、三磷酸腺苷等)激活，也因此成為目前國內(nèi)外研究最廣泛、最深入的一類炎癥小體，激活后的炎癥小體可通過天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)對白介素-1β(IL-1β)及白介素-18(IL-18)前體物質(zhì)進(jìn)行水解，最終產(chǎn)生并釋放活性 IL1β、IL-18 炎癥因子，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生[8]。本研究借助現(xiàn)代測量工具及分析儀器，將甘草的性狀特征定量化，與根據(jù)抗炎生物效價分級后的甘草樣品進(jìn)行整合分析，考察各性狀特征與抗炎活性的關(guān)聯(lián)度，旨在考察甘草傳統(tǒng)感官評價能否準(zhǔn)確地反映其抗炎活性，以期為甘草感官評價的實際應(yīng)用提供參考，并為其科學(xué)性提供數(shù)據(jù)支持。

　　1 材料

　　1.1 儀器CM-5 型色彩色差儀

　　(日本柯尼卡美能達(dá)公司);FOX 3000 型電子鼻系統(tǒng)(法國 Alpha MOS 公司);聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)系統(tǒng)、TC10 型自動細(xì)胞計數(shù)儀均購自美國 Bio-Rad 公司;潔凈工作臺(北京冠鵬凈化設(shè)備有限公司);臺式高速離心機、恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱均購自美國 Thermo公司;HW·SY11-K 型電熱恒溫水浴鍋(北京市長風(fēng)儀器儀表公司);KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);OV200 型臺式真空冷凍離心濃縮儀(北京吉艾姆科技有限公司);立式壓力蒸汽滅菌器(重慶雅馬拓科技有限公司);微量移液器(德國 Eppendorf 公司);PromegaGloMax 20/20 型發(fā)光檢測儀(美國 Promega 公司)。

　　1.2 材料與試劑

　　C57BL/6 雌性小鼠 2 只(9~11 周齡)，購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，實驗動物倫理審查編號為 IACUC-2020-0037。DMEM 培養(yǎng)基(批號：K0111200)，磷酸緩沖鹽溶液(PBS，批號：K0911200)，乙二胺四乙酸(EDTA，0.5 mol·L–1，批號：K1905010)，胰蛋白酶(Trypsin)-EDTA 消化液(0.25%，批號：K1207050)，均購自美國 Macgene 公司;opti-MEM 培養(yǎng)基(批號：31985070，美國 Gibco 公司);巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-csf，批號：#87394，美國 MedChemExpresss 公司);胎牛血清(FBS，批號：2037144，以色列 Biolnd 公司);尼日利亞菌素(Nigericin，批號：HY100381)，脂多糖(LPS，批號：tlrl-ppglps)，均購自美國 Invivogen 公司;二甲基亞砜(DMSO，批號：No.1121E0327，德國 Sigma-Aldrich 公司)。

　　IL-1β ELISA 檢測試劑盒(批號：2018-3，北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司);CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay(批號：0000418489)，CaspaseGlo®1 Inflammasome Assay(批號：0000443211)均購自美國 Promega 公司。NLRP3、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(ASC)及 Caspase-1 抗體均購自美國 Adipogen 公司;IL-1β 抗體購自美國 R&D 公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠 IgG 抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔 IgG 抗體購自美國 Santa Cruz 公司。10 個批次甘草樣品編號 S1~10，批號分別為 S1(J180228001)、S2(H190077001-3)、S3( 20032604 ) 、 S4 ( H190080001-3 ) 、 S5 ( H190074001-3 ) 、 S6 ( H190078001-3 ) 、 S7(C200015001)、S8(J170042001)、S9(H190075001-3)、S10(CA180140001)，經(jīng)解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心肝病研究所肖小河研究員鑒定均為烏拉爾甘草 Glycyrrhiza uralensis Fisch。

　　2 方法

　　2.1 供試品的制備按照

　　《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)2020 年版方法[1]制備甘草提取液，抽濾，精密吸取續(xù)濾液 10 mL 分裝于專用離心管中，于臺式真空冷凍離心濃縮儀中揮干溶劑至恒重，–20 ℃保存，備用。給藥時現(xiàn)配現(xiàn)用，在離心管中加入 opti-MEM 培養(yǎng)基 1 mL 重溶，超聲 30 min 使其溶解至無明顯固體顆粒，0.22 µm 微孔濾膜濾過后即得。

　　2.2 甘草抗炎生物效價的測定

　　2.2.1 細(xì)胞的獲取及培養(yǎng)

　　酒精消毒后，取 C57BL/6 的雌性小鼠后腿骨，將裝滿 DMEM 培養(yǎng)基的 5mL 注射器注入骨髓，在裝有 20 mL DMEM 培養(yǎng)基的離心管中反復(fù)吹打骨髓 3 次，吹打過程中保持后腿骨在培養(yǎng)基液面以下，加入 5 µL M-csf，吹勻，將含有細(xì)胞的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)皿中，20 ℃恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。3 天后，補充適量的 DMEM 培養(yǎng)基和 M-csf，繼續(xù)培養(yǎng) 2 天。

　　然后，將貼壁的小鼠原代骨髓巨噬細(xì)胞(BMDMs)細(xì)胞用消化液(Trypsin-EDTA∶EDTA=2∶1)消化 1~2 min 后，更換DMEM 培養(yǎng)基，并制成細(xì)胞密度為 1×106 cells/mL 的培養(yǎng)基溶液，吸取 500 µL 的含細(xì)胞的培養(yǎng)基于 24孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)，于 20 ℃恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁。2.2.2 NLRP3 炎癥小體細(xì)胞模型的構(gòu)建 首先，棄去 24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)的 DMEM 培養(yǎng)基，加入含有 LPS(50 ng·mL–1)的 opti-MEM 培養(yǎng)基，20 ℃恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)靜置 4 h;然后，設(shè)置空白組、模型組及給藥組，棄去孔板內(nèi)的 opti-MEM 培養(yǎng)基，給藥組分別加入生藥濃度為 0.312 5、0.625 0、1.250 0、2.500 0 mg·mL–1的藥液，空白組及模型組加入等量 opti-MEM 培養(yǎng)基，20 ℃恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)與細(xì)胞共培養(yǎng) 1 h;最后，模型組及給藥組內(nèi)加入 Nigericin(50 µg·mL–1，DMSO)溶液，空白組加入含有等質(zhì)量濃度 DMSO 的 opti-MEM 培養(yǎng)基，20 ℃下共培養(yǎng) 30 min，收集細(xì)胞上清液及裂解液。

　　2.2.3 關(guān)鍵指標(biāo)的檢測

　　通過蛋白質(zhì)印跡(Western blot)法對細(xì)胞上清液中的 IL-1β、Casepase-1 蛋白及裂解液 NLRP3、pro-IL-1β、pro-Casepase-1、ASC 等蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測，并應(yīng)用 Image J 1.8.0 軟件對目的蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析。取 BMDMs 上清液及裂解液前處理后，電泳，再經(jīng)轉(zhuǎn)膜將蛋白條帶轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，經(jīng)過孵育相應(yīng)的一抗及二抗抗體，顯影，在 X 光片上顯示蛋白條帶。通過 Caspase-Glo®1 Inflammasome Assay 檢測試劑盒對細(xì)胞上清液中 Casepase-1 的表達(dá)量進(jìn)行檢測，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。通過酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)測定法對細(xì)胞上清液中 IL-1β 的表達(dá)量進(jìn)行檢測，具體操作按照 IL-1βELISA 檢測試劑盒說明書進(jìn)行。

　　通過 CellTiter-Glo(CTG)發(fā)光法檢測細(xì)胞毒性。取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的小鼠 BMDM 細(xì)胞，分別設(shè)置空白孔、對照孔及梯度濃度給藥孔(生藥濃度為 0.312 5、0.625 0、1.250 0、2.500 0 mg·mL–1)，孵育 6 h 后，吸取細(xì)胞上清液 50 µL 轉(zhuǎn)移至 96 孔白板中，每孔加入 CTG 溶液 50 µL，振蕩 1 min，測定各孔發(fā)光值，并通過公式(1)計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率 =給藥孔發(fā)光值−空白孔發(fā)光值對照孔發(fā)光值−空白孔發(fā)光值 ×100% (1)

　　2.2.4 生物效價的標(biāo)化

　　IL-1β 炎癥因子是 NLRP3 炎癥小體介導(dǎo)表達(dá)的下游關(guān)鍵蛋白，且實驗結(jié)果相對穩(wěn)定，故采用 ELISA 測定法檢測 IL-1β 的表達(dá)量，來表征甘草的生物效價。以 MCC950 為陽性對照化合物，依據(jù)《中國藥典》2020 年版(四部)[9]【生物檢定統(tǒng)計法】項下的“量反應(yīng)平行線法”對甘草醇提物抑制小鼠 BMDM 細(xì)胞分泌 IL-1β 活性的效價值進(jìn)行標(biāo)化。定義MCC950 的生物效價為 1000 U·mg–1，將抑制率和相應(yīng)給藥濃度輸入效價計算軟件 BioCalculate V2.0 得到各個批次甘草抑制小鼠 BMDM 細(xì)胞分泌 IL-1β 的效價。

　　2.3 感官參數(shù)的數(shù)據(jù)采集

　　2.3.1 甘草斷面直徑的測量 10 個批次甘草樣品均為類圓形片，若為類橢圓形片，則以其短直徑作為斷面直徑測量結(jié)果。為了減小實驗誤差，每批次樣品隨機取 3 組，每組 100 個飲片作為測量對象[10]，記錄其斷面直徑 2R。2.3.2 甘草色度的測定 色度常用的評價系統(tǒng)是 CIE 1976 L*a*b*標(biāo)準(zhǔn)色度系統(tǒng)，其中 L*表示明度，a*和b*表示不同的色調(diào)方向。L*值越大明度越大，感覺越白;反之越暗。a*表示紅綠方向，+a*表示紅方向，–a*表示綠方向。b*表示黃藍(lán)方向，+b*表示黃方向，–b*表示藍(lán)方向[11]。采用色彩色差儀對甘草粉末進(jìn)行色度測量。取適量甘草粉末加入專用容器中，在容器底部平鋪成3~5 mm 厚度，校準(zhǔn)儀器后，將其放置于測定凹槽內(nèi)進(jìn)行色度測量，記錄甘草樣品的 L*、a*和 b*值。每批次樣品重復(fù)測定 3 次，取其色度指標(biāo)的平均值。

　　2.3.3 甘草氣味的測定

　　為了使樣品在利用電子鼻檢測時響應(yīng)值達(dá)到最佳狀態(tài)，參考文獻(xiàn)[12-13]方法對樣品進(jìn)樣量、頂空溫度及頂空時間進(jìn)行單因素考察。精密稱取甘草粉末 0.2 g，置于 10 mL 頂空瓶中，在頂空溫度 40 ℃，頂空時間 120 s 條件下，分別考察進(jìn)樣量為 500、1000、2000、2500 µL 時樣品的響應(yīng)值;精密稱取甘草粉末0.2 g，置于 10 mL 頂空瓶中，在頂空時間 120 s，進(jìn)樣量 2500 µL 條件下，分別考察頂空溫度為 40、45、50、55 ℃時樣品的響應(yīng)值;精密稱取甘草粉末 0.2 g，置于 10 mL 頂空瓶中，在頂空溫度 55 ℃，進(jìn)樣量 2500 µL 條件下，分別考察頂空時間為 120、240、360 s 時樣品的響應(yīng)值。

　　取同一批次甘草樣品(S7)重復(fù)測定 5 次，計算 12 個傳感器的 RSD(%)值以考察電子鼻儀器精密度。12 個傳感器 LY2/LG、LY2/G、LY2/AA、LY2/Gh、LY2/gCTl、LY2/gCT、T30/1、P10/1、P10/2、P40/1、T70/2、PA/2 的 RSD 值分別為 1.449%、2.933%、2.211%、0.435%、3.278%、1.356%、1.756%、1.133%、1.343%、0.935%、1.641%、1.536%，RSD 值均小于 4%，說明儀器精密度良好。

　　2.4 數(shù)據(jù)分析

　　將采集的甘草樣品感官數(shù)據(jù)及等級劃分?jǐn)?shù)據(jù)導(dǎo)入 Simca 14.1 軟件中，進(jìn)行主成分(PCA)分析，并基于 PCA 分析進(jìn)行正交偏最小二乘法(OPLS-DA)分析，以增大組間差異，更好地挖掘與甘草抗炎活性相關(guān)的關(guān)鍵感官參數(shù)。根據(jù) PCA 分析及 OPLS-DA 分析的得分圖，判斷兩等級甘草樣品的差異。根據(jù)OPLS-DA 分析的 loading 圖及 VIP 值確定兩者間的差異成分，并通過獨立 t 檢驗分析兩者差異成分的統(tǒng)計學(xué)差異，驗證 OPLS-DA 分析結(jié)果。3 結(jié)果3.1 甘草提取物對 Nigericin 誘導(dǎo)的小鼠原代骨髓巨噬細(xì)胞 NLRP3 炎癥小體的影響經(jīng)過 Western blot 法檢測空白組、模型組及給藥組 BMDM 細(xì)胞上清液及裂解液中各關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，結(jié)果見圖 3 A，再通過灰度值分析對關(guān)鍵蛋白 IL-1β、Casepase-1 及其前體蛋白 pro-IL-1β 及 proCasepase-1 的條帶進(jìn)行量化，結(jié)果見圖 3 B~E，以判斷甘草提取物是否產(chǎn)生抑制作用。

　　Lamin B 為細(xì)胞裂解液的上樣量對照，考馬斯藍(lán)(Coomassie)染色為上清液的上樣量對照。實驗結(jié)果顯示，與模型組相比，給藥組細(xì)胞上清液中目的蛋白 IL-1β、Casepase-1 的灰度值明顯降低，即其表達(dá)量顯著減少，并且隨著給藥濃度的增大，兩種蛋白的表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸減少的趨勢，而在裂解液中兩蛋白的前體蛋白 proIL-1β 及 pro-Casepase-1 的表達(dá)則恰恰相反，說明甘草提取物能夠抑制 pro-IL-1β 及 pro-Casepase-1 的剪切，從而抑制 LPS 聯(lián)合 Nigericin 誘導(dǎo)的小鼠 BMDM 細(xì)胞上清液中 IL-1β、Casepase-1 蛋白的表達(dá)。通過試劑盒進(jìn)一步檢測 IL-1β 的表達(dá)及 Casepase-1 的活性，結(jié)果見圖 4 A、B，發(fā)現(xiàn)甘草提取物對 IL-1β 的表達(dá)有抑制作用，并能夠抑制 Casepase-1 的活性，且在 0.312 5~2.500 0 mg·mL–1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈一定的劑量依賴性;并對甘草提取物的細(xì)胞毒性進(jìn)行了檢測，甘草提取物在 2.500 0 mg·mL–1質(zhì)量濃度時對 BMDM 細(xì)胞無毒性作用，故選取 0.312 5~2.500 0 mg·mL–1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)進(jìn)行藥效檢測。

　　4 討論

　　近年來，已經(jīng)有研究報道了甘草中的活性成分對 NLRP3 炎癥小體的影響，并對其作用機制進(jìn)行了深入研究。Li 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，異甘草素通過抑制磷酸化核因子-ĸB(p-NF-ĸB)、NLRP3 的蛋白質(zhì)的分泌，促進(jìn) Caspase-1、IL-1β 和消皮素蛋白 N 端(GSDMD-N)的裂解，上調(diào)微小核苷酸(miRNA)-27amRNA 表達(dá)，并降低脾酪氨酸激酶(SYK)的 mRNA 和蛋白質(zhì)水平等方式抑制 NLRP3 介導(dǎo)的焦亡。付書彬等[15]報道，甘草查爾酮 A 可通過抑制 Caspase-1 前體的剪切，阻斷 Caspase-1 p20 介導(dǎo)的 pro-IL-1β的成熟,抑制 NLRP3 炎癥小體介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)。Xu[16]等也發(fā)現(xiàn)了甘草中的活性成分對 NLRP3 炎癥小體的抑制作用。目前，甘草提取物對炎癥小體的作用尚無人進(jìn)行驗證，本研究在前人研究的基礎(chǔ)上構(gòu)建了炎癥小體細(xì)胞模型，確定了在體外甘草提取物對 LPS 誘導(dǎo)的小鼠 BMDM 細(xì)胞 NLRP3 炎癥小體激活的抑制作用，并通過檢測其下游關(guān)鍵蛋白 IL-1β 的表達(dá)量建立了不同批次甘草樣品的生物效價，為甘草質(zhì)量評價提供新的方法。自古以來，顏色就在甘草質(zhì)量評價中占據(jù)了重要地位。

　　中醫(yī)草藥論文投稿刊物：新中醫(yī)期刊投論文要求

　　《本草經(jīng)集注》記載：“赤皮斷理，…最佳…[17]”《新編中藥志》記載：“甘草以皮細(xì)緊、色紅棕、斷面黃白色…為佳。[18]”可見，在古代，甘草以外皮色赤、色紅棕，斷面色黃白者為佳。隨著科技的進(jìn)步，研究者們利用現(xiàn)代儀器對甘草的顏色進(jìn)行了更深入的研究。曹光昭[19]等將甘草的止咳藥效與其色度值進(jìn)行相關(guān)性分析，初步確定了色度值 b*與其止咳藥效的相關(guān)性。本研究通過現(xiàn)代機器視覺客觀量化了甘草的性狀參數(shù)，彌補了性狀評價方法過于依賴經(jīng)驗的不足之處，大大提高了其客觀性，減低了因評價人員不同而導(dǎo)致的質(zhì)量評價差異，并且經(jīng)過進(jìn)一步與其抗炎活性進(jìn)行整合分析，確定了甘草的色度值 b*與甘草抗炎活性的相關(guān)性較強。但是，由于市場上多為烏拉爾甘草，本研究未收集到脹果甘草和光果甘草樣品，并且應(yīng)用樣品量較小，可加大樣品量以及其他基原甘草樣品進(jìn)行進(jìn)一步驗證。

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　　作者：王鈞楠 1，周永峰 2，3，崔園園 2，鞏穎 4，柏兆方 2，朱廣偉 5，華國棟 6*，張萍 2*